Lilloa 53 (2): 193–216, 2016
193
García-Breijo, Francisco J.
1-2*
; Vicente Calatayud
3
;
José Reig-Armiñana
2
1
Departamento de Ecosistemas Agroforestales. Universitat Politècnica de València. Camino de Vera s/n,
(46022) Valencia (España)
2
Laboratorio de Anatomía Vegetal «Julio Iranzo». Jardín Botánico de la Universitat de València. ICBIBE C/
Quart, 81. (46008) Valencia (España)
3
Fundación CEAM, c/ Charles R. Darwin 14, Parque Tecnológico, (46980) Paterna, Valencia, (España).
* Autor corresponsal: fjgarci@eaf.upv.es
Recibido: 29/06/16 – Aceptado: 11/10/16
Estudio anatómico-histológico de las flores del
endemismo Lamottea diania (Asteraceae) y de los
efectos del ozono troposférico sobre su desarrollo
Resumen — García-Breijo, Francisco J.; Vicente Calatayud; José Reig-Armiñana. 2016.
“Estudio anatómico-histológico de las flores del endemismo Lamottea diania (Asteraceae) y de
los efectos del ozono troposférico sobre su desarrollo”. Lilloa 53 (2). Plantas del endemismo
Lamottea diania se expusieron en cámaras OTC (Open Top Chambers) a aire ambiente filtrado
y a aire ambiente no filtrado más 30 ppb de ozono para observar el efecto de este contami-
nante sobre el desarrollo de sus flores, particularmente sobre su androceo. Hemos compro-
bado, mediante estudios de microscopía óptica y electrónica, que el ozono afecta el proceso
de desarrollo y maduración de los estambres y del polen. Las anteras se ven afectadas, en
unos casos al abortar algunos estambres en su desarrollo y, en otros, impidiéndose el desa-
rrollo correcto de los sacos polínicos en el interior de las mismas. Asimismo, el ozono impide
la formación correcta del polen encontrando numerosos granos de polen sin desarrollar o
desarrollados y madurados de forma anómala en el interior de los sacos polínicos. Los resul-
tados indican que el ozono es el responsable del desarrollo anormal del androceo y del polen
en plantas de L. diania.
Palabras clave: Anatomía; Carthamus dianius; endemismo; esporogénesis; estrés abióti-
co; histología floral; ozono; polen; ultraestructura.
Abstract — Garcia-Breijo, Francisco J.; Vicente Calatayud; José Reig-Armiñana. 2016.
“Anatomical and histological study of endemism flowers of Lamottea diania (Asteraceae) and
the effects of tropospheric ozone on their development”. Lilloa 53 (2). Plants of endemism
Lamottea diania were exposed in cameras OTC (Open Top Chambers) to filtered ambient air
and ambient air unfiltered over 30 ppb ozone to observe the effect of this pollutant on the
development of its flowers, particularly on its androecium. We have found, through studies of
optical and electron microscopy, that ozone affects the process of development and matura-
tion of stamens and pollen. The anthers are affected, in some cases by aborting some sta-
mens in their development and in other, prevented the proper development of the pollen sacs
within them. In addition, ozone prevents proper formationand maturation of pollen found many
undeveloped pollen grains or developed abnormally inside the pollen sacs. Results indicate that
ozone was responsible for the abnormal development of androecium and pollen in L. diania.
Keywords: Abiotic stress; anatomy; Carthamus dianius; endemism; floral histology; ozone;
pollen; sporogenesis; ultrastructure.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad, el ozono (O
3
) troposfé-
rico se considera uno de los contaminantes
atmosféricos más importantes del planeta y
el más importante de los que actúan sobre
las plantas (Ainsworth et al., 2012; Ashmo-
re, 2005; IPCC, 2013; Karnosky et al., 2007;
Matyssek et al., 2007, Paoletti, 2007, Wittig
et al., 2009), causando graves pérdidas en
cosechas (Asensi-Fabado, 2007; Asensi-Faba-
do et al., 2010) e induciendo una serie de
efectos perjudiciales en la vegetación nativa
(Krupa et al., 2001). Durante las pasadas
F. J. García-Breijo et al.: Estudio anatómico-histológico de Lamottea diania
194
décadas, se ha observado un incremento glo-
bal del O
3
troposférico, especialmente en el
Hemisferio Norte. Esto ha sido atribuido ini-
cialmente al incremento en los precursores
del O
3
de origen antropogénico (Volz y Kley,
1988). El Mediterráneo es un área crítica
para la formación de fotooxidantes (Millán
et al., 1992; Sanz et al., 2007). Es una zona
densamente poblada (abundan por lo tanto
los precursores del O
3
) que se ha descrito
como un gran reactor fotoquímico donde la
intensa radiación solar, las altas temperatu-
ras y los procesos de recirculación de las
masas de aire contaminadas favorecen la
formación de este contaminante (Lelieveld
et al., 2002; Millán et al., 1996, 1997,
2002; Sanz y Millán, 1998). Como conse-
cuencia, las concentraciones de O
3
alcanzan
niveles fitotóxicos especialmente en verano
(Bussotti y Ferretti, 1998; Fumagalli et al.,
2001; Reinert et al., 1992; Sanz y Millan,
1998, 2000; Velissariou et al., 1992).
Hasta ahora, muy pocos trabajos se han
realizado sobre los efectos que los agentes
contaminantes tienen sobre las especies vege-
tales endémicas o raras. Algunos trabajos no
publicados han estudiado los efectos del ozo-
no sobre las hojas de Lamotea diania
(Webb.) G. López (Asteraceae) (Serna-
Riddell, 2006) o sobre las flores de Centran-
thus ruber (L.) DC. (Valerianaceae) (García-
Sebastiá, 2006). Las especies con poblacio-
nes relativamente pequeñas pueden ser más
vulnerables a la contaminación y a otras
amenazas no sólo debido a sus reducidas
áreas de distribución o al bajo número de in-
dividuos, sino también a su más baja varia-
bilidad genética, que puede limitar sus posi-
bilidades de adaptación a los cambios en su
hábitat. Desde un punto de vista botánico, la
región mediterránea es el área más diversa
de Europa, con muchas plantas que son bien
endémicas o/y de distribución reducida.
Como ejemplo, de las 9000 especies de la
flora española, 1571 taxa se enumeran en la
lista roja (Moreno, 2008), y más de 400 es-
tán en peligro.
Una de las maneras de identificar los
impactos del O
3
en una planta es la observa-
ción de lesiones en las hojas visibles en las
especies sensibles (Feng et al, 2014; Schaub
y Calatayud, 2013). Con el fin de identificar
correctamente los síntomas de O
3
de otros
producidos por otros factores bióticos o
abióticos, los estudios de microscopía han
demostrado ser una herramienta muy útil
(Günthardt-Goerg y Vollenweider, 2007; Vo-
llenweider et al., 2003). A diferencia de
otros contaminantes, el O
3
no se acumula en
los tejidos celulares, pero induce una serie
de cambios anatómicos y ultraestructurales
característicos que pueden variar en diferen-
tes plantas (Bussotti et al., 2005; Calatayud
et al., 2011; García-Breijo et al., 2008;
Reig-Armiñana et al., 2004; Vollenweider et
al, 2003). Las observaciones de campo, sin
embargo, tienen que ser apoyadas por estu-
dios de referencia en condiciones controla-
das o semi-controladas (en Open Top Cham-
bers (OTC) o en otros sistemas de exposi-
ción), en el que las respuestas de las diferen-
tes especies a O
3
pueden reproducirse y ca-
racterizarse.
El ozono puede afectar directamente a
las estructuras reproductivas, a saber, super-
ficies del estilo o del estigma, polen, ante-
ras, frutos y semillas. Las concentraciones
actuales de O
3
disminuyen significativamente
el número de semillas (-16%), el número de
frutos (-9%) y el peso de los frutos (-22%)
en comparación con el aire filtrado (Black
et al., 2000). Además, la germinación del
polen y el crecimiento del tubo polínico dis-
minuyen con concentraciones elevadas de
O
3
en comparación con el aire filtrado
(Leisner y Ainsworth, 2012).
Ya se han realizado estudios sobre la vul-
nerabilidad de L. diania a los niveles cada
vez mayores de ozono troposférico (Calata-
yud et al., 2011). Estos estudios han comple-
mentado unos preliminares donde se demos-
tró que el ozono también producía efectos
deletéreos en la reproducción de esta espe-
cie, incluyendo una reducción significativa
en el número de flores producidas por la
planta, y un aumento en la producción alte-
rada del polen (García-Breijo et al., 2005).
El objetivo principal del trabajo es el es-
tudio anatómico-histológico a nivel estructu-
ral y ultraestructural del efecto producido
Lilloa 53 (2): 193–216, 2016
195
por el ozono troposférico sobre las anteras
de L. diania y, especialmente, sobre su desa-
rrollo ontogénico y sobre la producción de
polen e intentar correlacionar estos efectos
con las dificultades reproductoras de esta
especie que puedan poner en peligro su con-
tinuidad.
Lamottea diania (Webb) G. López (sin.
Carthamus dianius Webb) es un nanofaneró-
fito, hierba de tronco leñoso que forma unos
capítulos con flores de color blanco amari-
llento y brácteas espinescentes.Tiene hojas
basales muy divididas en lóbulos lanceola-
dos (Fig. 1). Florece en los meses de mayo y
junio.
Las poblaciones más importantes (Fig. 2)
y pujantes se sitúan en las zonas umbrías del
Montgó pero no existe estimación precisa de
sus efectivos. Stübing y Estévez (1990) en el
estudio multidisciplinar sobre el Parque Na-
tural del Montgó (38°482 303 N 0°072 003
E) estiman que este endemismo dianico-pi-
tiúsico es una de las plantas más interesan-
tes de este macizo montañoso. Hay otras
poblaciones de menor entidad en acantilados
litorales y en barrancos o zonas de matorral
de algunas sierras colindantes. En Ibiza se
presenta constituyendo pequeñas poblaciones
(6) localizadas en la costa norte (cala NaXa-
mena, Penyal de s’Aguila, cala Aubarca, Es
Alls, Ses Torretes y cala d’En Sardina). Tam-
bién vive en el islote de s’Espartar, donde es
abundante, tanto en los cinglos de tramonta-
na como en la parte más alta.
L. diania es un endemismo (microareal)
emblemático en España en gran riesgo de
desaparición a medio plazo ya que en los
últimos años se ha comprobado una gran
desaparición de poblaciones.El interés del
estudio de esta especie es evidente ya que el
«Catálogo Nacional de Especies Amenaza-
das» y el «Listado de Especies Silvestres en
Régimen de Protección Especial» la presenta
dentro de la categoría de plantas «De interés
Fig. 1. A) Hábito de la planta mostrando el aspecto de las hojas, tallos y flores. B) Detalle
del capítulo con brácteas epinescentes y flores actinomorfas blanquecinas.
F. J. García-Breijo et al.: Estudio anatómico-histológico de Lamottea diania
196
especial» (Real Decreto 139/2011 de 4 de
febrero de 2011 y en sus actualizaciones por
las órdenes AAA/75/2012 de 12 de enero y
AAA/1771/2015 de 31 de agosto) y la
«IUCN» (International Unionfor Conservation
of Nature) la cataloga como «VU» (vulnera-
ble, en alto riesgo de extinción en estado
silvestre a medio plazo) siendo los criterios
y subcriterios para su catalogación: «C2a»
(declinación continua en el número de indi-
viduos maduros estando todos ellos en una
sola sub-población) y «D2» (área de ocupa-
ción menor de 100 km
2
o en menos de 5 po-
blaciones).
MATERIAL Y MÉTODOS
1. MATERIAL VEGETAL
El material utilizado fue obtenido a partir
de las semillas recolectadas durante la cam-
paña 2007-2008 procedentes del Parque Na-
tural del Macizo de «El Montgó» (Alicante,
Comunidad Valenciana; España; 38º48’ 30’’
N; 0º07’00’’E; UTM: 4299457 249632 31 S).
Las plántulas se colocaron en envases de
7L que fueron rellenados con una mezcla de
50% de turba de coco, 30% de turba, 10%
de arena y 10% de vermiculita. El pH fue de
7,0. Se incorporó al medio un fertilizante de
lenta liberación (Osmocote plus), y un apor-
te de NPK 20:10:20. Las plantas fueron irri-
gadas dos veces al día usando un sistema de
goteo. Para las experiencias, doce plantas
fueron mantenidas en aire filtrado, y otras
12 fueron expuestas al ozono.
2. CÁMARAS «OPEN-TOP» (OTC) Y
EXPOSICIÓN AL OZONO
Las muestras procesadas se obtuvieron
tras el tratamiento de las plantas de L. dia-
nia en cámaras OTCs bajo condiciones de
fumigación controladas. Estos tratamientos
con ozono fueron realizados en el campo
experimental de la Fundación CEAM en la
«LaPeira» (Benifaió, Comunidad Valenciana,
España; 39º16’14.8'’N, 00º26’59.6'’W, 30 m
snm). Las plantas fueron distribuidas en seis
cámaras de techo abierto (OTC), con dos
Fig. 2. Mapa de distribución de L. diania.
Lilloa 53 (2): 193–216, 2016
197
tratamientos (3 cámaras por el tratamiento):
1º) con aire filtrado a través filtros de carbo-
no (CF), y 2º) con aire no filtrado más una
concentración de ozono de 30 ppb (NF+30).
Esta concentración era ligeramente superior
a las concentraciones más altas medidas en
áreas de montaña del este de España (Millán
et al., 2002). El ozono fue generado a partir
de oxígeno usando un generador de descar-
ga eléctrica de alto voltaje (Sir sa), y la cali-
dad del aire dentro y fuera de las cámaras
fue supervisada continuamente (a intervalos
regulares) con un monitor de ozono (Dasibi
1008-AH, Environmental Corp.). Los trata-
mientos comenzaron el 12 de mayo y termi-
naron el 8 de septiembre, tras lo que las
plantas fueron cosechadas.
Las muestras de flores se recogieron los
días 16 de junio, 23 de junio (2 y 3 semanas
después del comienzo de la floración) y el 7
de julio (4 semanas después de la floración
cuando el 50% de las flores había alcanzado
la antesis). Se tomaron cada vez muestras
de 3 plantas, 5 capítulos por planta. Las
hojas de las plantas tratadas mostraron a
simple vista síntomas de daños producidos
por el ozono a diferencia de las muestras de
flores donde no se apreciaron daños.
Durante los tratamientos, las plantas fue-
ron expuestas al ozono 8 h al día, desde las
10:00 a las 18:00 CET, todas las semanas.
Para los periodos de tratamientos, se calcu-
laron las medias a 24, 12 y 8 h, así como el
AOT40, es decir, la exposición acumulada
sobre un umbral de 40ppb (80 mg m
-3
), ba-
sado en promedios cada hora, durante las
horas de luz día desde las 8:00 a las 20:00
CET.
3. CONTROL DE SÍNTOMAS
VISIBLES
Todas las plantas fueron examinadas dia-
riamente por el personal del campo experi-
mental para detectar los primeros síntomas.
La intensidad de los síntomas visibles produ-
cidos por el ozono era anotada semanal-
mente y registrado tanto el porcentaje de
hojas afectadas por planta (HA), como el
porcentaje del área afectada (AA) en las ho-
jas con síntomas en cada planta. Para eva-
luar el daño total en la planta, se calculó un
Índice de Daño Total (IDT) combinando es-
tos dos parámetros: IDT= (HAxAA) /100.
4. SENESCENCIA Y REPARTO
DE LA BIOMASA
Las hojas senescentes fueron recogidas
regularmente durante el experimento y el
peso seco acumulado por la planta fue cal-
culado sobre una base de dos semanas. Al
final de los experimentos (5-8 de septiem-
bre), las 24 plantas fueron recogidas, y la
biomasa aérea (hojas, vástagos y flores) y
subterránea (raíces) fue calculada por sepa-
rado después de secada en el horno en 60ºC
hasta peso estable.
5. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Las diferencias entre los diferentes tipos
de hojas considerados eran resueltas usando
un análisis ANOVA seguido de un test LSD
(Least Significant Difference). Un nivel de
probabilidad de <0,05 se consideró estadís-
ticamente significativo. Los datos fueron
analizados usando el software SPSS
®
10.0
para Windows (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.).
6. MÉTODOS MICROSCÓPICOS
Las muestras de las flores fueron fijadas
in situ con una mezcla de formaldehido-áci-
do acético-alcohol etílico (FAA) (para traba-
jar en microscopía óptica, MO) y luego al-
macenadas en nevera, o con Karnovsky mo-
dificado (2% de paraformaldehido y 2,5%
de glutaraldehido; Karnovsky, 1965), (para
trabajar en microscopía electrónica, TEM).
Las muestras en Karnovsky se fijaron durante
12 horas, y luego se lavaron en tampón fos-
fato 0,1M y pH 7,4. Posteriormente, se post-
fijaron en OsO
4
al 2% durante 2 horas, se
lavaron en tampón fosfato 0,1M y pH 7,4 y,
finalmente, se guardaron en refrigerador
hasta su manipulación posterior.
6.1. Observación en microscopía óptica.—
Las muestras fijadas con FAA se sometieron
a los tratamientos siguientes:
Una parte de las muestras se incluyeron
en parafina. Para ello primero se deshidra-
taron en series de etanol (50%, 70%, 80%,
F. J. García-Breijo et al.: Estudio anatómico-histológico de Lamottea diania
198
96% y absoluto) durante 15 minutos en cada
uno de ellos y luego fueron introducidas en
acetato de isoamilo durante 1 h. A continua-
ción, se introdujeron en una mezcla de xile-
no-parafina a 55ºC durante 1 h, luego en
parafina líquida durante 1 h y, finalmente, se
confeccionaron los bloques de parafina me-
diante el uso de casetes histológicos de in-
clusión (TissueTek
®
). Los bloques fueron
cortados en secciones de 10 µm con un mi-
crótomo rotatorio AngliaScientific 500 y te-
ñidos con safranina-verde rápido (Johansen,
1940).
Otra parte de las muestras se incluyeron
en resina LR-White
®
Hard Grade (London
Resin Company). Para ello primero se deshi-
drataron en series de etanol (50%, 70%,
80%, 96% y absoluto) durante 15 minutos en
cada uno de ellos y luego fueron introduci-
das en Ependorf
®
conteniendo mezclas de
etanol absoluto-resina (2:1) durante 1 h, eta-
nol absoluto-resina (1:1) 1 h, y etanol abso-
luto-resina (1:2), durante toda la noche y
destapado para permitir que el etanol se
evaporara. Finalmente, las muestras fueron
incluidas en resina pura contenida en cápsu-
las BEEM (8 mm I.D.) que se cerraron y
guardaron en estufa a 60ºC durante 24 ho-
ras para su polimerización. Las secciones
semifinas (1,5 µm) de estos bloques se lleva-
ron a cabo en un ultramicrótomo Ultratome
Nova LKB Bromma, con cuchillas de dia-
mante DIATOME Histo 45º y se tiñeron con
azul de toluidina al 0,1% (Feder y O’Brien,
1968). Finalmente, otras muestras se guarda-
ron para su observación en LTSEM.
Todas las secciones fueron observadas
con un microscopio óptico OLYMPUS Provis
AX 70 equipado con un equipo de epifluores-
cencia. En nuestro caso, las observaciones
con fluorescencia y autofluorescencia se rea-
lizaron con un cubo de fluorescencia U-
MWU (excitation filter: 330-385nm; barrier
filter: 420nm; dichroic Mirror: 400 nm). To-
das las imágenes fueron fotografiadas con
una cámara digital Lumenera Infinity 2-3C
digital CCD color camera (2080 x 1536 re-
solution) y tratadas posteriormente con los
programas Infinity Analyze® v. 4.6.0 y
Photoshop CS5®.
6.2. Observación en TEM.— Las muestras
fijadas con Karnovsky y post-fijadas con
OsO
4
se deshidrataron en series de etanol
(50%, 70%, 80%, 96% y absoluto) durante
15 minutos en cada uno de ellos y luego se
incluyeron en resina LR-White® Hard Grade
(London Resin Company) siguiendo el mis-
mo procedimiento que para los cortes semi-
finos. Las secciones ultrafinas (80 nm) se
cortaron en un ultramicrótomo Ultratome
Nova LKB Bromma, con cuchillas de dia-
mante DIATOME Ultra 45º, se recogieron
sobre rejillas de cobre de 100 mesh con ayu-
da de asas PerfectLoop (EMS) para ultrami-
crotomía, y se tiñeron con citrato de plomo
al 2% durante 10 min (Reynolds, 1963) y
con acetato de uranilo 2% durante 5 min
(Watson, 1958).
Para la observación de las mismas se usó
un microscopio electrónico de transmisión
PHILIPS CM10 a 80kV, dotado de una cáma-
ra digital MegaView III y un software de ad-
quisición de imágenes «AnalySIS» del Servi-
cio de Microscopía Electrónica de la Univer-
sidad Politécnica de Valencia.
6.3. Observación en LTSEM.— Algunas
muestras fijadas en FAA se emplearon para
su observación en un microscopio de barri-
do de baja temperatura (LTSEM). Para ello,
las muestras hidratadas fueron depositadas
en un portaobjetos especial y congeladas con
nitrógeno líquido. Posteriormente, fueron
sublimadas a -90ºC durante 10 min. Una vez
introducidas en la pre-cámara del microsco-
pio se recubrieron con oro durante 60 s. Fi-
nalmente, se visualizaron bajo un voltaje de
10 kV en un microscopio electrónico Cryo-
SEM (JSM-5410 LV Scanning Microscope,
JEOL, Japón) interconectado con un sistema
de crio-transferencia (Cryotrans CT1500,
Oxford Instruments, Oxford, Reino Unido) y
dotado con un sistema digital de adquisición
de imágenes INCA-Point & ID (Oxford Ins-
truments) del Servicio de Microscopía Elec-
trónica de la Universidad Politécnica de Va-
lencia.
Lilloa 53 (2): 193–216, 2016
199
RESULTADOS
1. CONCENTRACIONES DE OZONO
Las concentraciones de ozono ambiente
en el sitio experimental durante el período
entero de la exposición (del 12 de mayo al 8
de septiembre, un total de 120 días) fueron
moderados (Tabla 1). En los tratamientos
realizados en aire filtrado con carbono (CF,
control), las concentraciones medias de ozo-
no cada hora se situaron por debajo de 15
ppb, mientras que en los tratamientos
NF+30, las concentraciones medias cada
hora estuvieron cercanas a 40 ppb. Otros
medios descriptivos y exposiciones acumula-
das se proporcionan en la Tabla 1.
2. EVOLUCIÓN DE LOS SÍNTOMAS
VISIBLES
Después de 3 días de exposición al trata-
miento NF+30, se observaron los primeros
síntomas en las hojas de L. diania: un amari-
lleamiento que afecta solamente a la superfi-
cie intervenal superior de las hojas más vie-
jas, mientras que las hojas más jóvenes no se
mostraron afectadas. Después de 15 días, los
12 individuos del tratamiento NF+30 eran
sintomáticos. Los síntomas nunca fueron
observados en el tratamiento de los CF du-
rante el curso del experimento. Los síntomas
visibles fueron inicialmente muy evidentes,
luego se estabilizaban hasta el día 57, y fi-
nalmente se producía de nuevo un aumento.
El último aumento correspondió a un perío-
do en el cual más de la mitad de las flores
habían alcanzado la antesis, las semillas
estaban maduras (Fig. 3), y la senescencia
de las hojas viejas muy acelerada.
3. EFECTOS SOBRE LA ANATOMÍA
DE LAS FLORES
Las flores blanquecinas de L. diania están
agrupadas en capítulo, técnicamente calati-
dio, (Fig. 1B) y sentadas sobre un receptáculo
o clinanto. Las brácteas medias del involucro
pueden llevar o no apéndice cocleariforme.
Las flores son pequeñas y hermafroditas, con
simetría actinomorfa (Fig. 1B) e hipanto
ausente.El cáliz tiene los sépalos profunda-
mente modificados, formando un papus o vi-
lano de tipo piloso. El vilano es doble, persis-
CF
NF+30
Aire ambiente
Tabla 1. Concentraciones medias de ozono para diversas ventanas diarias de tiempo, AOT40
y valor máximo por hora alcanzados para el período completo cubierto por este experimento
(del 18 de mayo al 8 de septiembre de 2008). El periodo de 8 h, a partir del 10 a 18 h,
cubrió las horas en las cuales las plantas del tratamiento NF+30 fueron expuestas a los
niveles crecientes del ozono. CF = Filtro de carbono; NF+30 = aire no filtrado + 30 ppb ozo-
no. El aire ambiente no es un tratamiento sino que se refiere a los niveles del ozono medidos
en el lugar experimental fuera de las OTCs.
Media 24 h
Media 12 h
[8-20 CET]
Media 8 h
[10-18 CET]
Valor máx/hora
AOT40
[8-20 CET]
(ppb)
10,8
39,8
31,6
(ppb)
10,3
64,8
45,6
(ppb)
12,3
72,2
48,1
(ppb)
30,8
110,3
86,0
(ppb*h)
0
35019
10866
Fig. 3. Evolución del índice de daños en la
planta Los datos se refieren únicamente a
los tratamientos con ozono. Media ± d. e., n
= 12 plantas.
F. J. García-Breijo et al.: Estudio anatómico-histológico de Lamottea diania
200
tente, con cerdas lignificadas en la base, que
a veces falta en los aquenios externos o en to-
dos; vilano externo con cerdas lineares, de
longitud desigual, ± planas, algo cortas y
regularmente ciliadas; vilano interno con
cerdas más cortas y conniventes, sentadas so-
bre una base claviforme esclerificada.
La corola es gamopétala, con 5 pétalos
formando un tubo (corola tubulosa o flóscu-
lo) con 5 lóbulos (Fig. 4C). Los pétalos pre-
sentan epidermis adaxial y abaxial monoes-
tratificadas. Sus células son prismáticas con
paredes celulares periclinales externas muy
desarrolladas y con una gruesa cutícula, for-
mada de capa cuticular y ceras (Fig. 5A, 5C
y 5E). El parénquima consta de entre 3 y 6
células dependiendo de la parte del pétalo
considerada. Las células son pequeñas y ape-
nas dejan espacios intercelulares entre ellas
(Fig. 5A, 5C y 5E). En la parte tubulosa de
la flor, los pétalos se unen unos con otros a
través de células epidérmicas modificadas
(Fig. 5A y 5C). En los bordes de los mismos
suelen aparecen dos conductos secretores
junto a los haces vasculares (Fig. 5A y 5C).
El androceo presenta 5 estambres, los
cuales alternan con los lóbulos de la corola
(Fig. 4A y 4C). Las anteras son basifijas y se
unen entre sí, formando un tubo alrededor
del estilo (Fig. 4A y 4C). Las anteras presen-
tan dehiscencia longitudinal e introrsa. Los
granos de polen usualmente son tricolpora-
dos (Fig. 4D y 4E). Cada antera contiene
cuatro sacos polínicos (microsporangios)
que se disponen por pares en dos lóbulos.
Estos lóbulos se separan por una zona de te-
jido estéril que se denomina conectivo; a tra-
vés de este tejido de unión atraviesa el hace-
cillo conductor (Fig. 4C).
El gineceo está formado por 2 carpelos
connados, con ovario ínfero y unilocular.
Presenta un solo óvulo anátropo, con 1 tegu-
mento y un delgado megasporangio (Fig.
4B). La placentación es basal. El gineceo
presenta un estilo que usualmente posee en
su ápice un nectario. El estilo se halla dividi-
do distalmente en dos ramas estilares, que
presentan papilas estigmáticas en su cara
adaxial dispuestas en dos líneas separadas
(Fig. 4C).
Cuando la flor es muy joven, la antera no
consta más que de protodermis y una masa
de meristemo fundamental. El tejido esporó-
geno (con 2 capas de células iniciales) se
desarrolla solamente en las cuatro zonas de
la esquina de la antera en desarrollo (figura
suplementaria S1A y S1B).La capa interna
forma las células esporógenas primarias,
que por divisiones ulteriores forman las célu-
las madres de las micrósporas. La capa supe-
rior de las células iniciales citadas forma las
células parietales primarias, de las que se
forma la pared de los sacos polínicos y una
gran parte del tapete, como resultado de di-
visiones periclinales y anticlinales.
Las células esporógenas primarias comien-
zan a dividirse mitóticamente en diferentes
planos al tiempo que se desarrolla la pared
del saco polínico (Fig. 7A). De estas divisiones
derivan las células madres de las micróspo-
ras, llamadas también microsporócitos (Fig.
6A y 7A). Estas células son ricas en citoplas-
ma y presentan una pared muy delgada de
pectocelulosa. No dejan apenas espacios in-
tercelulares (Fig. 6C y 7A y suplementaria
S1C). El citoplasma tiene una estructura muy
simple, apareciendo sus constituyentes distri-
buidos al azar. Existe una gran comunicación
intercelular mediante canales citoplásmicos y
plasmodesmos (Figura suplementaria S1D).
Los núcleos presentan numerosos poros nu-
cleares (Figura suplementaria S1E). También
son muy abundantes los ribosomas.
Más tarde, cada célula madre sufre una
meiosis y forma una tétrada de granos de
polen, que equivalen a cuatro micrósporas
haploides (Fig. 6). Poco antes de la reduc-
ción meiótica la membrana primaria del
microesporócito se sustituye por capas grue-
sas de calosa (Fig. 6F). Al finalizar el proce-
so meiótico las micrósporas haploides se
aíslan en la tétrada rodeándose cada una de
una pared de calosa y sin plasmodesmos que
las conecten con sus células hermanas.
Al mismo tiempo que se constituye la té-
trada, las células del tapete de cada antera
crecen y comienzan a formar unos cuerpos
esféricos específicos (los pro-orbículos; Fig.
6B). En el estado de tétrada avanzado apa-
recen entre la membrana plasmática y la
Lilloa 53 (2): 193–216, 2016
201
Fig. 4. A) Sección longitudinal de una flor muy madura filtrada con las anteras abiertas.
100x. B) Sección longitudinal de un detalle del tálamo y del ovario ínfero con un primordio
seminal anátropo. 200x. C) Sección transversal de una flor muy madura filtrada con las
anteras ya abiertas. 100x. D) Micrografía en LTSEM de un detalle del estilo y de las papilas
estigmáticas. 750x. E) Micrografía en LTSEM de granos de polen en una flor madura filtrada.
1500x. Referencias: An: anteras; Br: brácteas de la flor; Cli: clinanto; Co: conectivo. Col:
colpos; Ec: ectexina. Ep: epidermis; Es: estilo bífido; Fi: filarias ; In: Intina; Nu: nucela; Ov:
ovario; PA: placa axial; PE: papilas estigmáticas; Pe: pétalos; PEs: Papilas estilares; Po:
polen; PS: primordio seminal; Ta: tálamo o receptáculo; Te: tecas; Vi: vilano (cáliz).
F. J. García-Breijo et al.: Estudio anatómico-histológico de Lamottea diania
202
Fig. 5. A) Sección transversal de dos pétalos de una flor madura filtrada (detalle). Sección
semifina teñida con azul de toluidina. 200x. B) Sección transversal del pétalo de una flor
fumigada (4 semanas) mostrando alteraciones producidas por el ozono: protrusiones pectiná-
ceas (flechas discontinuas), zonas de degradación de la pared celular (asteriscos). 400x. C)
Micrografía de LTSEM de un pétalo de una flor madura filtrada. 1000x. D) Micrografía de
LTSEM de un pétalo de una flor fumigada (4 semanas) mostrando daños de la acción del
ozono: alteración en la forma de las células del mesófilo y presencia de numerosos espacios
intercelulares.1500x. E) Micrografía de LTSEM de un pétalo de una flor madura mostrando
un conducto secretor.1000x.F) Micrografía de TEM de un pétalo afectado. Detalle de protru-
siones pectináceas (flechas discontinuas) y zonas de degradación de la pared celular (asteris-
co). Referencias: CS: conducto secretor; Cu: cutícula; EI: espacio intercelular; EpAb: epider-
mis abaxial; EpAd: epidermis adaxial; F: floema; HV: haz vascular; M: mesófilo; PC: pared
celular; T: tonoplasto; X: xilema.
Lilloa 53 (2): 193–216, 2016
203
pared celular del tapete, que desaparece
paulatinamente. Al mismo tiempo que se
deposita la esporopolenina en los báculos de
la ectexina, también se recubren los pro-or-
bículos formando orbículos o corpúsculos de
Ubisch.
Las células del tapete son notoriamente
grandes, ricas en protoplasma y pueden ser
multinucleadas o poliploides ya que en ellas
ocurren varias mitosis irregulares y fusiones
nucleares (Fig. 6, 7A y 7C). Poseen un citoplas-
ma muy complejo, con abundantes ribosomas
libres, mitocondrias, retículo endoplásmico y
dictiosomas (Fig. 8E y 9A). El tapete es de
tipo glandular o de secreción, ya que las célu-
las permanecen en su posición original para
desintegrarse más tarde (Fig. 6 y 8E) y ser
absorbido su contenido por las células ma-
dres de polen y por los mismos granos duran-
te su desarrollo (Fig. 8).
Antes de la liberación de los granos polí-
nicos las paredes celulares del endotecio se
engrosan, a excepción de la pared tangen-
cial externa que contacta con el exotecio.
Cada engrosamiento tiene forma de «U» con
la luz dirigida hacia el exotecio (Fig. 7E, 8A
y 8B). Esta capa responde de la dehiscencia
del saco polínico que en L. diania es longitu-
dinal según una línea que se extiende entre
los dos sacos polínicos de cada teca. Antes
de la dehiscencia el tejido existente entre los
dos sacos de la teca suele desintegrarse, que-
dando esta zona sólo recubierta por el exote-
cio antes de la dehiscencia.
El grano de polen adulto se encuentra
rodeado por una capa de celulosa, la intina.
Por fuera de la intina hay otra capa llamada
exina. El componente principal de la exina
es un polímero de esporopolina (el pollen-
kitt) suministrado a partir de las células del
tapete (Fig. 8E, 9A y 9C). La exina en L. dia-
nia consta de una parte externa esculpida, la
ectexina, y una interna, la endexina. La en-
dexina, que cubre completamente a la inti-
na, forma generalmente una capa lisa. La
endexina se deposita bajo la ectexina. Ini-
cialmente el proceso comporta gran número
de laminillas de baja densidad electrónica
que parecen nacer del citoplasma (Figura
suplementaria S1F) y forman las bases en
torno a las cuales se deposita la esporopole-
nina. Al depositarse la esporopolenina, las
laminillas engrosan y se funden unas con
otras para formar la endexina. En la endexi-
na madura no se distinguen las laminillas.
Las esculturas de la ectexina resultan de la
disposición radial de los báculos, de extre-
midades engrosadas. Son de diferentes ta-
maños y pueden disponerse aislados o agru-
pados. En L. diania, los extremos de los bá-
culos se sueldan formando un téctum, con lo
que resulta tectado; este téctum presenta a su
vez la superficie esculpida de modo caracte-
rístico (Fig. 10A y 10C).
El ozono produce efectos evidentes sobre
el desarrollo de las flores de L. diania aun-
que menos evidentes a nivel macroscópico
que los producidos en las hojas. Estos efec-
tos, además, tardaron más en aparecer debi-
do a que la floración comenzó tiempo des-
pués de comenzado el tratamiento (3 sema-
nas más tarde) alcanzándose el 50% de la
antesis casi dos meses después de comenza-
do el mismo. En cualquier caso, la recogida
de muestras de flores se hizo a las 2, 3 y 4
semanas del inicio de la floración. Los da-
ños anatómicos comenzaron a ponerse de
manifiesto a partir de la 3-4 semanas. Los
datos comentados a continuación, se corres-
ponden con estas muestras.
Los primeros efectos que produce el ozo-
no sobre las flores ocurren en los pétalos.
Son efectos parecidos a los que se manifies-
tan en las hojas (Calatayud et al., 2011)
pero mucho menos agresivos, ya que en nin-
gún caso se apreciaron los colapsos celulares
típicos de hojas tratadas durante mucho
tiempo. En los pétalos, se observa una pro-
gresiva degradación de las paredes celulares
parenquimáticas lo que se traduce en la apa-
rición de protrusiones pectináceas, debilita-
miento de las paredes con la consiguiente
pérdida de forma de las células, aumento
importante de los espacios intercelulares y
zonas donde las láminas medias se deshacen
de forma evidente (Fig. 5B, 5D y 5F). Asi-
mismo, los haces vasculares sufren ligeros
daños en su floema, que aparece con algunas
de sus células taponadas con depósitos den-
sos (Figura suplementaria S2A).