55
Acta zoológica lilloana 61 (1): 55–64, Junio 2017
Comparación de métodos de extracción de ADN para
el género Astylus (Coleoptera: Melyridae)
Martín, Eduardo
1,2
; María Macarena Moreno Ruiz Holgado
2
;
Gabriela María Silenzi Usandivaras
1
; Marcela Bonano
2
1
Instituto de Genética, Fundación Miguel Lillo. Miguel Lillo 251, San Miguel de Tucumán, Tucumán,
Argentina.
2
Facultad de Ciencias Naturales e IML. Universidad Nacional de Tucumán. Miguel Lillo 205, San Miguel
de Tucumán, Tucumán, Argentina.
E-
mail: eduardomartin76@hotmail.com
ä
Resumen — Una extracción exitosa de ADN es fundamental para el progreso de estudios
biológicos que incluyen identificación molecular, inferencia filogenética y genómica así como
análisis de secuencias. Si bien los métodos de extracción de ácidos nucleicos son universales,
ellos deben ser ajustados de acuerdo a las características de cada taxón estudiado. El objetivo
del presente trabajo es comparar métodos de extracción de ADN y orientar en la elección del
protocolo más conveniente según las capacidades de cada laboratorio. Se evaluaron cuatro
métodos de extracción de ADN de ejemplares del género Astylus atromaculatus (Coleoptera:
Melyridae), tomando como indicadores la concentración y pureza del ADN extraído, la can-
tidad de material de partida necesario y los costos económicos y de tiempo. Los métodos
comparados fueron: 1) KIT comercial “HIGH Pure PCR Template Preparation Kit”
©
Roche; 2)
Precipitación salina con SDS; 3) Precipitación salina con CTAB y 4) Columnas de giro. Los
cuatro métodos dieron resultados positivos en cuanto a cantidad y calidad de ADN; respecto
al material de partida óptimo las muestras de medio abdomen y un segmento de pata fueron
las de mayor rendimiento. El protocolo de CTAB brindó mejores resultados de concentración
y pureza. Los protocolos de SDS y COLUMNAS DE GIRO produjeron valores intermedios de
concentración y pureza, destacándose el último por su bajo costo económico. El KIT comercial
fue el de menor rendimiento y mayor costo económico, pero a la vez fue el más rápido de
ejecutar.
Palabras clave: Purificación de ADN, Precipitación salina, Kit comercial, Columnas de
giro.
ä
Abstract — A successful extraction of DNA is fundamental for the progress of biologi-
cal studies that include molecular identification, phylogenetic inference and genomics as well
as sequences analyses. Although the methods of extraction of nucleic acids are universal,
they must be adjusted according to the characteristics of each taxon studied. The aim of the
present work is to compare DNA extraction methods and guide in the choice of the most
convenient protocol according to the capacities of each laboratory. Four methods of DNA
extraction were evaluated in the genus Astylus atromaculatus (Coleoptera: Melyridae) Taking
as indicators DNA final concentration and quality, amount of starting material and, cost and
time required. The evaluated methods were: 1) Commercial “HIGH Pure PCR Template Prepa-
ration Kit”
©
Roche; 2) Saline precipitation method with SDS; 3) Saline precipitation method
with CTAB and 4) Spin columns method. The four methods showed positive results regarding
to the quantity and quality of DNA; with respect to starting material, the best result was
provided by half abdomen and one segment of the leg. CTAB method was the best accord-
ing to the concentration and quality of the DNA. SDS and SPIN COLUMNS methods showed
intermediate values of concentration and purity, standing out the SPIN COLUMNS for its low
cost. KIT extraction method showed the lower performance but the faster method.
Keywords: DNA purification, Salt precipitation, Commercial Kit, Spin-Columns.
Recibido: 06/10/16 – Aceptado: 11/04/17
56
E. Martín et al.: Comparación de métodos de extracción de ADN para el género Astylus
INTRODUCCIÓN
El éxito de numerosos estudios biológicos
que incluyen la identificación molecular, la
inferencia filogenética y genómica, así como
los crecientes proyectos de secuenciación a
gran escala, dependen fundamentalmente de
un primer paso que consiste en la extracción
de ADN a partir de los organismos en estu-
dio (Falcón y Valera, 2007; Dittrich-Schröder
et al., 2012). Los diferentes métodos de ex-
tracción combinan procesos de lisis celular,
eliminación de proteínas, precipitación y
purificación del ADN, los cuales dan como
resultado variaciones en concentración y
calidad del ADN extraído (Waldschmidt et
al., 1997; Falcón y Valera, 2007; Chen et al.,
2008).
Una técnica ideal de extracción debe op-
timizar el rendimiento de ADN, minimizar
su degradación y ser eficiente en términos
de costo, tiempo, mano de obra y materia-
les. De igual manera debe ser adecuado para
la extracción de múltiples muestras y gene-
rar mínimos residuos peligrosos (Aljanabi y
Martinez, 1997; Chen et al., 2010; Cadavid
Sánchez et al., 2013: Asghar et al., 2015).
Las técnicas utilizadas comúnmente requie-
ren algún tipo de detergente como el Sodio
Dodecil Sulfato (SDS) o Bromuro de Cetil-
trimetilamonio (CTAB) para la extracción de
las moléculas de ADN a partir de diversos or-
ganismos. Además, demandan relativamente
mucho tiempo y requieren una campana de
extracción de gases para resguardar al ope-
rador del efecto tóxico de compuestos como
el fenol-cloroformo utilizado para la elimi-
nación de proteínas (Milligan, 1998; Falcón
y Valera, 2007; Chen et al., 2010). Estos mé-
todos además requieren de la presencia de
iones de sodio, etanol absoluto o isopropanol
que se utilizan comúnmente para precipitar
el ADN a partir de la solución acuosa. Otros
procedimientos de extracción utilizan co-
lumnas de giro o de centrifugación (“spin-
column”), las cuales poseen una membrana
de fibra de vidrio u otra matriz inorgánica a
la que se une el ADN, un buffer para la lisis
celular y un buffer de unión al ADN y poste-
rior elución (Ivanova et al., 2006). Existen
algunos kits comerciales que utilizan estas
columnas y son eficaces para extracción de
ADN de una amplia variedad de materiales
(ej.: sangre, cultivos celulares, tejido animal
y levaduras).
Estos métodos diversos, en general no es-
tán preparados para extracción en tejidos de
organismos específicos y deben ser ajustados
de acuerdo a las características especiales
de cada caso. Por ejemplo, los artrópodos
tienen un exoesqueleto que dificulta la ex-
tracción del ADN. Entre los artrópodos, el
orden Coleóptera es uno de los más numero-
sos dentro de Eucaria, con al menos 380.000
especies descriptas que ocupan una amplia
variedad de ambientes con una gran diversi-
dad morfológica, representan alrededor del
25% de las especies conocidas y casi el 40%
de los insectos (Slipiski et al., 2011; Ribera
y Beutel, 2012; McKenna et al., 2015). La
mayoría tiene una alimentación fitófaga y
por esta razón muchas especies se convierten
en plagas de cultivo, siendo principalmente
las larvas las que causan los daños agrícolas
y forestales. También hay especies saprófa-
gas, que se alimentan de material vegetal
en descomposición, otras coprófagas e in-
cluso algunas depredadoras. La variedad de
hábitos alimenticios dentro de este orden,
lo convierte en un grupo con un rol funda-
mental en el mantenimiento de la salud del
ecosistema y en el ciclo de los nutrientes.
El orden de los coleópteros se subdivide
en cuatro subórdenes, Adephaga, Archoste-
mata, Myxophaga y Polyphaga. En este últi-
mo se incluyen la mayoría de los coleópteros
actuales (al menos 300.000 especies), el cual
está subdividido en cinco infraórdenes, Bos-
trichiformia, Elateriformia, Scarabaeiformia,
Staphyliniformia y Cucujiformia (Ribera,
1999). En este último se encuentra la familia
Melyridae que incluye, sólo para Norteamé-
rica, 520 especies descriptas. Por otro lado
la representatividad de la fauna argentina
de melíridos en colecciones es bastante baja,
lo que coincide con la ausencia de taxóno-
mos argentinos trabajando en el grupo. De
acuerdo a la información recopilada de las
73 especies citadas para la Argentina, 62 se
podrían considerar endémicas, no obstante,
57
Acta zoológica lilloana 61 (1): 55–64, Junio 2017
es altamente probable que esta información
cambie toda vez que se precisen los datos
de recolección y/o se revisen los géneros
involucrados (Padilla Macilla, 2008). Los
individuos adultos se encuentran sobre las
flores de diferentes especies por lo que son
importantes polinizadores, aunque las lar-
vas de muchas especies son plagas. Dentro
de esta familia, son frecuentes los ejempla-
res del género Astylus, que alcanzan los 15
mm de longitud y élitros blandos, con pi-
losidad abundante y cabeza oculta en par-
te por el protórax. Por sus características,
la familia presenta implicancias ecológicas
y económicas que brindan un gran valor a
las investigaciones sistemáticas, ecológicas,
filogenéticas y de genética molecular, con-
ducentes a la identificación y control de las
diferentes especies de coleópteros (Asghar
et al., 2015).
En las últimas décadas se han reportado
numerosos trabajos sobre protocolos de ex-
tracción de ADN para diversos organismos,
asimismo se registran trabajos de análisis
moleculares en coleópteros en los que se
observa una amplia gama de variantes en
los métodos de extracción, los cuales deben
ser puestos a punto realizando algunas mo-
dificaciones para lograr su optimización de
acuerdo al análisis requerido. Esta tarea de
puesta a punto representa por lo general un
ejercicio cotidiano en laboratorios con am-
plia trayectoria, pero puede ser complicado,
costoso y hasta engorroso para laboratorios
con menor experiencia en trabajos molecula-
res. Por lo tanto, el objetivo general del pre-
sente trabajo es orientar en la elección del
método de extracción de ADN de coleópteros
más conveniente a utilizar de acuerdo a las
capacidades de cada laboratorio. Para ello se
evaluó el rendimiento de cuatro métodos de
extracción de ADN en coleópteros del género
Astylus atromaculatus, perteneciente a la fa-
milia Melyridae. Para la comparación entre
los protocolos, se tomaron cinco indicadores:
1) el rendimiento en cuanto a concentración
de ADN obtenido; 2) la pureza del ADN ex-
traído; 3) la cantidad de material de par-
tida necesario para una extracción exitosa;
4) el costo económico y 5) el costo referido
al tiempo invertido para llevar a cabo cada
método.
MATERIALES Y MÉTODOS
ColeCCión y preparaCión
de muestras
Para este estudio se utilizaron individuos
del género Astylus colectados en la localidad
de Ticucho (departamento Trancas, 37,3 Km
al N de la capital provincial, provincia de
Tucumán, 26°48’85.89”S, 65°24’08.90”O).
La captura se realizó de modo manual, en
un campo de maíz. El material se conservó
en alcohol al 95% y se mantuvo en frezzer
a -20
o
C hasta su análisis.
protoColos de extraCCión
de adn
Para la extracción del ADN total se uti-
lizaron cuatro métodos: 1) Protocolo de Kit
comercial HIGH Pure PCR Template Prep-
aration Kit
©
Roche (KIT); 2) Protocolo de
precipitación con SDS (SDS); 3) Protocolo
de precipitación con CTAB (CTAB); 4) Pro-
tocolo con columnas de giro (COLUMNAS
DE GIRO).
1) KIT. Contiene dos componentes prin-
cipales: una solución de lisis y una solución
para la precipitación de proteínas. El mate-
rial se colocó en un tubo eppendorf de 1,5
ml, se agregaron 200 µl del buffer de lisis
tisular más 40µl de proteinasa K (20 mg/ml)
reconstituida, se mezcló inmediatamente y
se incubó por una hora a 55°C o bien hasta
que la muestra quedó totalmente degrada-
da. Luego se añadieron 200 µl de buffer de
unión, se mezcló y se incubó por 10 minutos
a 70°C. Posteriormente se agregaron 100 µl
de isopropanol frío y se mezcló nuevamente.
Se extrajo la fase líquida con un tip descar-
table y se colocó dentro del tubo de filtro,
el cual estaba ensamblado en el tubo colec-
tor. El tubo colector con el tubo de filtro se
centrifugaron durante 1 minuto a 8000 g,
para luego descartar el tubo colector y el
líquido contenido en él. Se utilizó un nuevo
tubo colector y se añadieron 500 µl de buffer
inhibidor en la parte superior del reservorio
del tubo de filtro. Se centrifugó 1 minuto a
58
E. Martín et al.: Comparación de métodos de extracción de ADN para el género Astylus
8000 g. Se colocó un nuevo tubo colector
y se repitió el paso anterior. Se descartó el
líquido del tubo colector y se volvió a centri-
fugar durante 10 segundos a velocidad máxi-
ma. El tubo de filtro se insertó en un tubo
eppendorf, se agregaron 200 µl de buffer de
elución (precalentado a 70 °C), se centrifugó
por un minuto a 8000 g y se obtuvo en el
tubo eppendorf el ADN eluido final.
2)
S
DS. Se siguió el método según Chen
et al. (2010) con modificaciones. El buffer de
lisis se preparó con SDS al 0,5 % diluido en
200 mM de Tris, 25 mM de EDTA y 250 mM
de NaCl. En un microtubo de 1,5 ml se adi-
cionaron 150 µl de buffer de lisis y se agregó
la muestra a extraer, la cual se disgregó hasta
homogenizar. Luego se agregaron 350 µl más
de buffer de lisis y 5 µl de ARNasa 100 mg/
ml. Se incubó a 37 °C durante una hora, se
agregaron 5 µl de proteinasa K (20 mg/ml)
y se incubó nuevamente una hora a 50 °C.
El homogenizado se extrajo por separación
de fases con 240 µl de cloroformo/alcohol
isoamílico (24:1) y centrifugando a 12.000 g
por 10 minutos. El sobrenadante fue transfe-
rido a un nuevo tubo. Para precipitar el ADN,
se adicionaron 500 µl de etanol absoluto, se
centrifugó a 12.000 g durante 15 minutos. El
pellet se lavó dos veces con 500 µl de alco-
hol 70 % y finalmente se llevó a estufa a 37
°C durante 30 minutos hasta secar. Luego se
agregaron 100 µl de agua bidestilada para el
eluido final.
3)
C
TAB. Se siguió el método según
Chen et al. (2010) con modificaciones. El
buffer de lisis se preparó con CTAB al 2 %,
diluido en 100 mM de Tris HCL, 20 mM de
EDTA, 1,4 M de NaCl y b-mercaptoetanolal
0,2 %. Los pasos de extracción fueron igua-
les al protocolo con SDS antes descripto.
4)
C
olumnas de giro. Se siguió el méto-
do según Ivanova et al. (2006) modificado,
utilizando columnas de giro individuales en
lugar de placas. El buffer de lisis contiene
SDS al 0,5 % con 100 mM de NaCl, diluido
en 50 mM de Tris-HCl a pH 8 y 10 mM de
EDTA a pH 8. El buffer de unión contenía 6
M de Tiocianato de Guadinina (GuSCN), 20
mM de EDTA a pH 8; 10 mM de Tris-HCL a
pH 6.4 y Tritón X-100 al 4%. Este buffer fue
precalentado a 56 °C, hasta su disolución.
El buffer de mezcla estaba compuesto por
50 ml de etanol 96 %, y 50 ml de buffer
de unión. El buffer de lavado de proteínas
contenía 70 ml de etanol y 26 ml de buffer
de unión. El Buffer de lavado se preparó con
etanol 60 %, 50 mM de NaCl, 10 mM de
Tris-HCl a pH 7.4 y 0.5 mM de EDTA a pH
8.0. Previo a la extracción, se mezclaron 5
ml de buffer de lisis con 0,5 ml de protei-
nasa K (20 mg/ml). Luego se distribuyeron
50 µl de la mezcla anterior en cada tubo
eppendorf conteniendo la muestra, y se in-
cubaron durante toda la noche a 56°C. Al día
siguiente se centrifugaron los tubos a 1000 g
por 20 segundos. Luego se añadieron 100 µl
de buffer de mezcla y se centrifugó a 1000
g por 20 segundos. Se transfirieron 125 µl
del lisado obtenido a un tubo nuevo con las
columnas de giro y se centrifugó a 5000 g
por 5 minutos. El primer lavado se realizó
con 180 µl de buffer de lavado de proteínas
y se centrifugó nuevamente a 5000 g por 2
minutos, el segundo lavado se realizó con
750 µl de buffer de lavado y se centrifugó a
5000 g por 5 minutos. Luego se incubó a 56
°C por 30 minutos. Para obtener el ADN, se
añadieron 50 µl de agua bidestilada preca-
lentada a 56 °C en cada tubo y se incubó a
temperatura ambiente durante un minuto.
El ADN se obtuvo por centrifugación a 5000
g por 5 minutos.
e
stimaCión de rendimiento
y
pureza de adn
El éxito de las extracciones de ADN (n
= 56) se corroboró mediante corrida elec-
troforética horizontal en geles de agarosa al
1% en buffer TAE 1X (Figura 1). Para tal fin,
se sembraron 5 µl de eluido de cada mues-
tra, junto al buffer de carga con glicerol y
colorante intercalante de ADN GelRed. La
corrida se realizó por 30 minutos a un vol-
taje constante de 100 V. Las bandas de ADN
se observaron mediante luz ultravioleta en
transiluminador.
La cuantificación de ADN extraído de
cada muestra fue realizada mediante la uti-
59
Acta zoológica lilloana 61 (1): 55–64, Junio 2017
lización de un espectrofotómetro DENOVIX
DS11, con la lectura de la concentración de
ADN doble cadena a una absorbancia de
260 nm (A260 nm), en referencia al agua
desionizada como sustancia «blanco», que
permite establecer el valor 0 en la curva de
calibración.
La inferencia de la calidad del ADN fue
estimada en base a la relación A260 nm/
A280 nm. En general, el pico de absorción
UV es a 260 nm para ADN y a 280 nm para
proteínas, por lo tanto, cuando una solución
contiene tanto ADN como proteínas, la ab-
sorbancia a 260 nm es debida principalmen-
te al ADN presente, y la absorbancia a 280
nm se debe a proteínas. Una muestra pura
de ADN relativamente libre de contamina-
ción de proteínas, tiene la relación A260
nm/A280 nm de 1,8.
material de partida
El ADN genómico total fue extraído de
Astylus atromaculatus (Melyridae) a partir de
diferentes secciones del cuerpo que repre-
sentan distintas cantidades de material de
partida (Figura 2). Las muestras de trabajo
se enumeran en el listado a continuación: A)
un segmento de pata (0,162 +/- 0,1 mg); B)
dos segmentos de pata (0,330 +/- 0,3 mg);
C) una pata completa (0,490 +/- 0,4 mg);
D) dos patas completas (0,767 +/- 0,6 mg);
E) medio abdomen (2,500 +/- 2,0 mg); F)
un abdomen entero (6,300 +/- 0,6 mg); G)
un individuo completo (22,633 +/- 8,4 mg).
Todas las extracciones se realizaron por du-
plicado y para todos los casos fueron retira-
dos los élitros. Las muestras fueron pesadas
mediante una balanza analítica “Denver Ins-
trument”, APX 200, 200 g/0.1 mg.
C
osto eConómiCo y de tiempo
Para evaluar el costo económico de cada
protocolo, se calculó el valor de los reactivos
y material descartable utilizados. El tiempo
requerido para realizar la extracción a par-
tir del material biológico con cada método
fue estimado en base a los procedimientos
detallados anteriormente para cada proto-
colo, sumando 30 minutos de manipulación
de muestras por el operador. Debido a que
el tiempo de digestión puede ser variable,
en los resultados el tiempo final se expre-
Figura 1. Gel de agarosa al 1% donde se observa un ejemplo de 4 extracciones de ADN
genómico en cada método en Astylus. Se sembraron 5 µl del ADN eluido para cada muestra.
Figura 2. Secciones del cuerpo de Astylus utilizados para la extracción de ADN con sus re-
spectivos pesos: A) un segmento de pata; B) dos segmentos de pata; C) una pata completa; D)
dos patas completas; E) medio abdomen; F) un abdomen entero; G) un individuo completo.
60
E. Martín et al.: Comparación de métodos de extracción de ADN para el género Astylus
só como la suma del tiempo de digestión
determinado por cada autor más el tiempo
general del protocolo. Se excluyó el tiempo
empleado para la preparación de soluciones
en los métodos.
a
nálisis de datos
Los datos de rendimiento y calidad de
ADN fueron procesados con el programa RS-
tudio (RStudio Team, 2015). Se realizó un
análisis estadístico no paramétrico de Krus-
kal-Wallis (K-W). Como criterio de significan-
cia se estableció un valor de alpha de 0.05.
RESULTADOS
Los valores de la concentración promedio
de ADN (ng/µl) obtenido de las muestras y
determinados mediante espectrofotómetro
se encuentran en la Tabla 1. En la Figura 1
se muestra un ejemplo de una corrida elec-
troforética en gel de Agarosa para constatar
la presencia de ADN en los extractos.
Rendimiento y pureza de la extracción de
ADN según el protocolo utilizado.— De acuer-
do a los resultados de K-W no se encontraron
diferencias estadísticamente significativas
entre los protocolos en lo referido a la con-
centración de ADN obtenido. Al comparar
los resultados de pureza, se encontraron di-
ferencias entre los protocolos, agrupándose
inicialmente los de COLUMNAS DEGIRO y
CTAB, seguidos por SDS y KIT.
Rendimiento de la extracción de ADN se-
gún el material de partida.— Según los re-
sultados obtenidos por comparación entre
las muestras se diferencian dos secciones
estadísticamente diferentes (A y B). La sec-
ción A está integrada por: medio abdomen
(2,500 +/- 2,0mg) y un segmento (0,162
+/- 0,1mg). Mientras que la sección B está
compuesta por: 2 patas (0,767 +/- 0,6mg)
y un individuo (22,633 +/- 8,4mg). Además
se pudo observar un bloque intermedio entre
ellos (Bloque A-B) el cual está integrado por
las muestras: una pata (0,490 +/- 0,4mg),
un abdomen completo (6,300 +/- 0,6mg) y
dos segmentos (0,330 +/- 0,3mg).
Costo económico y de tiempo.— Los re-
sultados del análisis del costo se resumen
en la Tabla 2.
Tabla 1. Resultados de concentración según material de partida y protocolo utilizado, y re-
sultados de pureza obtenida con para cada protocolo.
61
Acta zoológica lilloana 61 (1): 55–64, Junio 2017
DISCUSIÓN
En este trabajo observamos que los cua-
tro protocolos analizados fueron útiles para
extraer ADN de coleópteros aún cuando los
protocolos no fueron diseñados específica-
mente para estos organismos. No encon-
tramos diferencias estadísticamente signifi-
cativas en cuanto al rendimiento entre los
cuatro protocolos analizados, esto se debe-
ría a la amplitud de cantidad del material
de partida utilizado, desde un segmento a
un individuo completo, y a que la variación
dentro de cada muestra también fue ele-
vada. Sin embargo, al observar los valores
de medias de concentración de ADN para
cada método (Tabla 1), nuestros resultados
se asemejan a los obtenidos por Chen et al.
(2010), quienes reportaron que los métodos
de SDS y CTAB fueron los de mejor rendi-
miento en su investigación con el gusano de
la raíz del maíz (Diabrotica virgifera). Por
otro lado, en nuestro trabajo, podemos ob-
servar que los protocolos del KIT y de CO-
LUMNAS DE GIRO fueron los que reflejaron
menores valores de concentración de ADN,
esto se debería a que las columnas de giro
con las que trabajamos estaban compuestas
por fibra de vidrio, las cuales serían menos
efectivas en las extracciones. Algunos auto-
res detectaron que los métodos de extracción
con columnas de giro de membrana de sílica
resultaron más eficientes (Hajibabaei et al.,
2005; Ivanova et al., 2006; Zetzsche et al.,
2008; Dittrich-Schröder et al., 2012), encon-
trando también variaciones en las tasas de
extracción de acuerdo a modificaciones en el
diámetro de la membrana. Aquellas con gran
diámetro generalmente resultan en una gran
cantidad de eluido de muy baja concentra-
ción, que no se puede utilizar directamente
para PCR (Zetzsche et al., 2008; Dittrich-
Schröder et al., 2012).
Los cuatro protocolos analizados mostra-
ron valores de relación de absorbancia (A260
nm/A280 nm) que reflejan ADN de buena
calidad. En general, las relaciones esperadas
para las muestras de ADN extraídas deben
aproximarse a 1,8, aceptando valores que
oscilan entre 1,7 y 2,0 (Chen et al., 2010).
Los protocolos de SDS y CTAB fueron los que
mostraron valores de relación de absorban-
cia más cercanos a 1,8, por lo tanto tuvieron
mayor pureza, seguidos por el protocolo de
COLUMNAS DE GIRO; mientras que el KIT
de extracción fue el que presentó los valores
de menor calidad. Estos resultados son im-
portantes debido a que si bien un método de
extracción contiene buena cantidad de ADN,
las técnicas moleculares subsiguientes, como
por ejemplo, una reacción de PCR, se ve-
rían afectadas por las presencia de proteínas
que con frecuencia permanecen en la solu-
ción estrechamente unida al ADN, incluso
la eliminación completa de la proteína no
siempre es posible (Chen et al., 2010). La
calidad de ADN también se afectaría por la
alta concentración de sales utilizadas para la
precipitación del mismo (Rodríguez-Romero
et al., 2011). Para mejorar la separación de
las proteínas del ADN se sugiere incluir en
los protocolos un paso de purificación con
fenol-cloroformo, pero este paso es poco de-
seable debido a la toxicidad del fenol, el cual
debe utilizarse con la protección de campa-
Tabla 2. Comparación entre costo económico y costo de tiempo por muestra para cada mé-
todo de extracción de ADN. En el costo tiempo se expresa el tiempo total y entre paréntesis
se desglosa el tiempo de digestión propuesto por cada autor sumado al procesado de las
muestras. El costo económico se encuentra expresado en pesos argentinos.
62
E. Martín et al.: Comparación de métodos de extracción de ADN para el género Astylus
nas de extracción de gases (Falcón y Valera,
2007; Chen et al., 2010; Dittrich-Schröder
et al., 2012). Los protocolos de Chen et al.
(2010) de SDS y CTAB, realizan un paso
con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico
(25:24:1). En cambio, en el presente trabajo
implementamos un paso de cloroformo/al-
cohol isoamílico (24:1), sin incluir fenol en
la mezcla. Con dicha modificación nuestros
resultados de pureza de ADN no difirieron
de los obtenidos con el protocolo original,
por lo cual recomendamos evitar el uso del
fenol contaminante.
En cuanto al material de partida, medio
abdomen y un segmento de pata resultaron
ser los más eficientes en cuanto a la relación
de peso de material de partida y ADN obte-
nido. Sin embargo, al observar las medias
de la concentración de ADN se deduce que
las muestras de mayor cantidad de material
(medio abdomen, abdomen entero e indivi-
duo entero) tienen mayores concentraciones
y que de hecho, serían de mayor utilidad
para aquellas investigaciones donde se re-
quieran importantes valores cuantitativos. Al
momento de elegir el material de partida, se
debe tener en cuenta que, cuando hay des-
trucción del individuo, no es posible conser-
var el mismo como ejemplar de referencia.
Esto no resulta útil para estudios que requie-
ran conservar el espécimen voucher; como
por ejemplo en los trabajos de generación
de la biblioteca de códigos de barras de la
vida (Barcode of life). Si bien las muestras
compuestas por patas mostraron menor con-
centración de ADN, la misma es suficiente
para el desarrollo de la mayoría de los aná-
lisis moleculares y permite conservar el es-
pécimen de referencia. En el trabajo de Rug-
man–Jones et al. (2006) utilizan el individuo
completo, haciendo un orificio a un lado del
abdomen, lo que resuelve el problema de la
conservación de espécimen ya que recupera
el exoesqueleto completo, pero para el de-
sarrollo de este protocolo se necesita mayor
tiempo (ver más abajo). Cabe destacar que el
KIT utilizado recomienda hacer la extracción
de 25 mg de tejido animal y en este trabajo
se emplearon cantidades menores, lo cual
es una ventaja para futuras investigaciones.
El costo económico de extracción también
es un factor a tener en cuenta. En este traba-
jo el protocolo de menor costo fue el de CO-
LUMNAS DE GIRO, seguido por los métodos
de extracción por sales y siendo el de mayor
costo el KIT comercial. Estos resultados son
coincidentes con trabajos referidos a esta te-
mática, la mayoría concluyen que los Kit co-
merciales resultan más costosos en términos
económicos (Ball y Armstrong 2008; Chen
et al., 2010; Cadavid Sánchez et al., 2013;
Dittrich-Schröder et al., 2012; Asghar et al.,
2015). Son recomendables para laboratorios
con equipamiento básico, dado que los otros
métodos imponen el uso de un laboratorio
experimental con mayor infraestructura,
como ser campanas de gases, balanzas y agi-
tadores entre otros. Si bien la utilización de
kit es costosa, la ventaja de su uso radica en
el tiempo de procesado de muestras, ya que
estos requieren menor tiempo que el resto
de los protocolos (Ball y Armstrong 2008;
Chen et al., 2010; Cadavid Sánchez et al.,
2013; Dittrich-Schröder et al., 2012; Asghar
et al., 2015). El protocolo de las COLUMNAS
DE GIRO requiere de un tiempo mayor del
que se emplea en los otros procedimientos,
esto se debe a que se realiza una digestión
toda la noche (“overnight”) equivalente a
8 horas, para efectivizar la extracción. Se
debe tener en cuenta que los tiempos de di-
gestión son ajustables de acuerdo al tipo de
muestras con las que se trabaje. Por ejemplo,
Rugman-Jones et al. (2006) realizaron una
digestión de 18 horas en insectos del orden
Thysanoptera. Ball y Armstrong (2008), en
un ensayo con una gran variedad de insec-
tos, obtuvieron mejores resultados de extrac-
ción cuando utilizaron tiempos intermedios
entre 30 minutos y 1 hora de digestión. Por
otra parte, en prácticas realizadas en nuestro
laboratorio con extracción de ADN de sangre
de aves, se obtuvieron excelentes resultados
con 20 minutos de digestión (datos no publi-
cados). Esto muestra que los tiempos de los
protocolos de extracción varían de acuerdo
al tiempo de digestión que se utilice y estos
en definitiva dependen del tipo de material
biológico utilizado, siendo recomendable
realizar ajustes del mismo para cada caso
63
Acta zoológica lilloana 61 (1): 55–64, Junio 2017
de estudio. Es debido a esto que en nuestros
análisis se separaron los tiempos de diges-
tión del resto del protocolo. Sin este tiempo,
el método del KIT sigue siendo el más veloz,
pero en este caso, el método de las COLUM-
NAS DE GIRO resulta más veloz en relación
a los de CTAB y SDS.
En los protocolos de extracción, otro
paso que incorpora variaciones en el tiempo
de operación, es el de incubación para la
precipitación del ADN. Chen et al. (2010)
encontraron poca variación en la eficiencia
de precipitación de ADN en relación al tiem-
po de incubación y recomiendan realizarla
durante toda la noche para muestras pe-
queñas (15 mg). Por otro lado, un elemento
que generalmente no es contemplado en los
análisis de tiempo, es el necesario para la
preparación de soluciones, el cual, en el caso
de los kits no se requieren, o sólo incluye el
agregado de etanol o agua bidestilada, mien-
tras que para los otros métodos se requieren
varios pasos para producir dichas soluciones
los cuales aumentan el tiempo de extracción.
Por ejemplo, en la preparación de fenol se
requiere de dos pasos de separación de fa-
ces, los cuales se recomiendan dejar toda la
noche.
CONCLUSIÓN
Los cuatro métodos comparados son efec-
tivos para la extracción de ADN en individuos
del género Astylus atromaculatus (Coleopte-
ra: Melyridae). Al evaluar los resultados ge-
nerales, indicamos que el protocolo de CTAB
fue el que brindó mayores beneficios, ya que
produce mejores valores de concentración y
pureza, además de no ser costoso en térmi-
nos de tiempo y dinero. Los protocolos de
SDS y COLUMNAS DE GIRO son de rendi-
miento medio, destacándose el último por
su costo económico reducido. Finalmente
el KIT, si bien mostró resultados positivos
en cuanto a extracción, fue el protocolo de
menor rendimiento y mayor costo, el cual es
sólo recomendable en términos de velocidad
y bajos requerimientos de laboratorio. Este
estudio brinda un avance en el conocimiento
de los protocolos de extracción de ADN para
coleópteros y otros insectos; y es útil para
laboratorios que se estén iniciando en esta
temática y que incluyan la identificación mo-
lecular, la inferencia filogenética y genómica
de coleópteros, como de otros insectos rela-
cionados. De igual forma, es útil también,
para aquellos estudios que requieren de la
preservación de los individuos para análisis
morfológicos asociados.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Mg. Graciela Ruiz de
Bigliardo y a la Lic. María Sara Caro por los
valiosos aportes realizados a este trabajo.
BIBLIOGRAFÍA
Aljanabi S. M., Martinez I.1997. Universal
and rapid salt-extraction of high qual-
ity genomic DNA for PCR based tech-
niques. Nucleic Acids Research, 25:
4692-4693.
Asghar U., Malik M. F., Anwar F., Javed A.,
Raza A. 2015. DNA Extraction from
insects by using different techniques:
A Review. Advances in Entomology, 3:
132-138.
Ball S. L., Armstrong K. F. 2008.Rapid, one-
step DNA extraction for insect pest
identification by using DNA barcodes.
Journal of Economic Entomology, 101:
523–532.
Cadavid Sánchez I. C., Rosero García D. C.,
Uribe Soto S. I. 2013. Comparación de
dos métodos de extracción de ADN a
partir de plantas del género Solanum,
subgénero Leptostemonum. Revista Co-
lombiana de Biotecnología, 15 (2): 186-
192.
Chen H., Rangasamy M., Tan S. Y., Wang H.,
Siegfried B. D. 2010. Evaluation of five
methods for total DNA extraction from
western corn rootworm beetles. PLoS
ONE 5: e11963. (doi:10.1371/journal.
pone.0011963).
Chen M., Zhu Y., Tao J., Luo Y. 2008. Meth-
odological comparison of DNA extraction
from Holcocerrushippophaecolus (Lepi-
doptera: Cossidae) for AFLP analysis.
For Study China, 10: 189–192.
Dittrich-Schröder G., Wingfield M.J., Keein
H.y Slippers B. 2012. DNA extraction
techniques for DNA barcoding of minute
gall-inhabiting wasps. Molecular Ecology
Resources, 12: 109-115.
64
E. Martín et al.: Comparación de métodos de extracción de ADN para el género Astylus
Falcón L.I., Valera A. 2007.Extracción de áci-
dos nucleicos. En Eguiarte, V. Souza y X.
Aguirre (compiladores), Ecología molecu-
lar. Instituto Nacional de Ecología. Uni-
versidad Nacional Autónoma de México.
Comisión Nacional para el Conocimiento
y Uso de la Biodiversidad, México, pp.
499-515.
Hajibabaei M., Ivanova N.V., Ratnasingham S.,
Dooh R. T., L Kirk S. L., Mackie P. M.,
Paul D. N., Hebert P. D. N. 2005.Criti-
cal factors for assembling a high volume
of DNA barcodes. Philosophical Trans-
actions of the Royal Society: Biological
Sciences, 360: 1959-1967.
Ivanova N. V., Dewaard J. R., Hebert P. N.
V. 2006. An inexpensive, automation-
friendly protocol for recovering high-
quality DNA. Molecular Ecology Notes,
6: 998-1002.
McKenna D.D., Wild A.L., Kanda K., Bel-
lamy C.L., Beutel R.G., Caterino M.S.,
Farnum C.W., Hawks D.C., Ivie M.A.,
Jameson M.L., Leschen R.A.B., Marval-
diA.E., McHugh J.V., Newton A.F., Rob-
ertson J.A., Thayer M.K., Whiting M.F.,
Lawrence J.F., Slipinski A., Maddison
D.R., Farrell B.D. 2015. The beetle tree
of life reveals that coleoptera survived
end-permian mass extinction to diversify
during the cretaceous terrestrial revo-
lution. The Royal Entomological Society.
Systematic Entomology, 46 pp.
Milligan B. G.1998. Total DNA isolation. In:
Hoelzel AR ( ed.) Molecular Genetic Anal-
ysis of Population: A Practical Approach,
2nd Edition. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press, pp. 29–64.
Padilla Macilla, P. 2008. “Melyridae” en Bio-
diversidad de Artrópodos Argentino. Vol.
2. Lucía E. Claps, Guillermo Debandi,
Sergio Roig-Juñent. 2008. Sociedad En-
tomológica Argentina, pp. 597-602.
Ribera I. 1999. Evolución, filogenia y clasifi-
cación de Coleoptera (Artropoda: hexa-
poda) Boletín SEA, 26: 435-458.
Ribera, I. & Beutel, R.G. 2012. Coleópteros.
Capítulo 31. En: Vargas, P y Zardoya,
R. (eds.) El árbol de la vida: sistemática
y evolución de los seres vivos. Madrid,
pp. 312-321.
Rodríguez Romero A., Posos Ponce P., Peteira
B., Suris M. 2011. Evaluación de tres
protocolos de extracción de ADN en in-
sectos del Orden Thysanoptera. Revista
de Protección Vegetal, 26:187-190.
RStudio Team. 2015. RStudio: Integrated De-
velopment for R. RStudio, Inc., Boston,
MA URL http://www.rstudio.com/
Rugman–Jones P. F., Hoddle M. S., Mound
L. A., Stouthamer R. 2006. Molecular
Identification key for pest species of
Scirtothrips (Thysanoptera: Thripidae).
Journal of Economic Entomology, 99:
1813-1819.
lipiski S. A., Leschen R. A. B., Lawrence
J. F. 2011. Order Coleoptera Linnaeus,
1758. In Animal biodiversity: an outline
of higher-level classification and survey
of taxonomic richness, Z. Q. Zhiang
(ed.). Zootaxa 3148: pp. 203-208.
Waldschmidt A. M., Salomão T. M. F., Bar-
ros E. G. Oliveira Campos L. A. 1997.
Extraction of genomic DNA from Meli-
ponaquadrifasciata (Hymenoptera: Api-
dae, Meliponinae). Brazilian Journal of
Genetics, 20: 421-423.
Zetzsche H., Klenk H. P., Raupach M. J., Kne-
belsberger T., Gemeinholzer B. 2008.
Comparison of methods and protocols
for routine DNA extraction in the DNA
bank network. In: Gradstein R, Klatt S,
Normann F, Weigelt P Willmann R, Wil-
son R (eds.) Systematics Universitäts-
verlagGöttingen, Göttingen, p. 354.
