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Lilloa 54 (2): 91100, 7 de diciembre de 2017
Variación en el contenido de clorofilas, carotenos y
antocianos en agallas inducidas por Neolithus spp.
(Hemiptera: Psyllidae) sobre Sapium haematospermum
(Euphorbiaceae)
ä
Resumen Agudelo, Ignacio; Marcelo Wagner; Rafael Ricco. 2017. Variación en el
contenido de clorofilas, carotenos y antocianos en agallas inducidas por Neolithus spp (He-
miptera: Psyllidae) sobre Sapium haematospermum (Euphorbiaceae). Lilloa 54 (2). Sapium
haematospermum Müll. Arg. (Euphorbiaceae) es un árbol nativo de América del Sur que suele
ser infestado por psílidos del género Neolithus, los cuales generan agallas en sus hojas. El
insecto induce cambios anatómicos y bioqmicos que resultan en la formacn de una nueva
estructura con una disposición de tejidos característica que cumple la función de proteger al
huésped. Se obtuvieron fotografías de agallas rojas, verdes y frutos. Se realizaron mediciones
espectrofotométricas de clorofila a y b, carotenoides y antocianos totales sobre agallas rojas,
verdes y hojas sanas. Se efectuaron cortes transversales para conocer la localización tisular
de los pigmentos y se caracterizó el aglicón principal mediante métodos cromatográficos y
espectroscópicos. Las agallas tuvieron una concentracn de clorofilas totales y carotenoides
mucho más baja que la de las hojas sanas. Los antocianos se encontraron únicamente en
la epidermis de la agalla roja, donde se regist mayor concentración de estos compuestos,
cuyo aglicón fue principalmente cianidina. La hoja sana y la agalla verde no tuvieron canti-
dades detectables de estos pigmentos. Las agallas registraron concentraciones menores de
pigmentos fotosinticos, lo que da idea del carácter de sumidero de fotoasimilatos de estas
estructuras. Los antocianos corresponden a glicósidos de cianidina principalmente y se ubican
en la epidermis externa; debido a esta localizacn cumplirían una función relacionada con la
defensa aposemática frente a predadores y la protección frente a la radiación UV.
Palabras clave: Sapium, psílido, agallas inducidas por insectos, antocianos, cyanidin, pig-
mento fotosintético.
ä
Abstract Agudelo, Ignacio; Marcelo Wagner; Rafael Ricco. 2017. Variation in the
content of chlorophylls, carotenoids and anthocyanins in galls induced by Neolithus spp (He-
miptera: Psyllidae) in Sapium haematospermum (Euphorbiaceae)”. Lilloa 54 (2). Sapium hae-
matospermum Müll. Arg. (Euphorbiaceae) is a tree native to South America and is usually
infested by psyllids of the Neolithus genus, which induce the formation of galls in its leaves.
The insect induces anatomical and biochemical changes that form a new structure with a
particular tissue arrangement to protect the host. Photographs of red galls, green galls and
mature fruit were obtained. Chlorophyll a and b, carotenoid pigments and anthocyanins were
measured by spectrophotometric techniques. Also transversal cuts were performed in order
to know the histological disposition of the anthocyanin compounds; the aglycone compound
was characterized by chromatographic and spectrophotometric methods.
Recibido: 01/09/17 Aceptado: 08/11/17
Variation in the Content of Chlorophylls, Carotenoids and
Anthocyanins in Galls Induced by Neolithus spp. (Hemiptera:
Psyllidae) in Sapium haematospermum (Euphorbiaceae)
Agudelo, Ignacio*; Marcelo Wagner; Rafael Ricco
Cátedra de Farmacobotánica, Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Uni-
versidad de Buenos Aires.
* Au
tor corresponsal: iagudelo@ffyb.uba.ar
92
I. Agudelo et al.: Variación en el contenido de pigmentos en agallas inducidas por Neolithus
Galls had a lower concentration of chlorophylls and carotenoids compared to healthy leaves.
Anthocyanins were found in the external epidermis of red galls; this organ had the largest
concentration of these pigments and the main aglycone was cyanidin. Green galls and healthy
leaves didnt have a detectable amount of these substances. Galls had a lower concentration
of photosynthetic pigments; this is an indicator of a reduced photosynthesis typical of pho-
toassimilates sinks. The anthocyanins are mainly cyanidin glycosides and are located in the
external epidermis; this indicates and aposematic and/or an UV-protection function.
Keywords: Sapium, psyllid, insect induced plant galls, anthocyanin, cyanidin, photosyntetic
pigment.
INTRODUCCIÓN
Sapium haematospermum Müll. Arg.
(Euphorbiaceae) es un árbol laticífero propio
de las regiones subtropicales de América del
Sur. Puede llegar a medir 10 metros de altu-
ra y posee corteza lisa y clara y hojas pecio-
ladas. Su fruto es una cápsula piriforme que
se abre dejando a la vista tres semillas de
color rojo. Es muy frecuente en lugares hú-
medos y forma parte de las selvas en galería
de la Argentina (Cabrera y Zardini, 1978).
Su látex posee proteasas y es empleado en la
medicina popular contra el dolor de muelas
(Lahitte, 1998).
Es infectado por psílidos del género Neo-
lithus que producen agallas en las partes
verdes de la planta como hojas y frutos in-
maduros; dichas agallas pueden estar solas
o asociadas y presentarse en color verde o
rojo. (Schneeberger, 1973).
Las agallas son estructuras anómalas in-
ducidas por insectos los cuales las emplean
como refugio para llevar a cabo parte de su
ciclo vital, obteniendo de esta manera tres
ventajas principales: protección de las con-
diciones ambientales, protección contra de-
predadores y una nutrición mejorada (Shor-
thouse y Rohfritsch, 1992; Hartley, 1998;
Stone y Schönrogge, 2003). Estas caracte-
rísticas llevan a alteraciones no sólo físicas
sino también en la expresión de metabolitos
secundarios (Braganca et al., 2016 ; Nyman
y Julkunen-Tiito, 2000; Guedes et al., 2016;
Rand et al., 2017).
Los antocianos son metabolitos secunda-
rios coloreados de naturaleza polifenólica y,
junto con los carotenos y las betalainas, son
los principales pigmentos de color distinto
del verde dentro de los vegetales superio-
res. Poseen numerosas funciones fisiológicas
y ecológicas relacionadas con la fotoprotec-
ción, el aposematismo y la antioxidación de
las estructuras subcelulares (Gould, 2004).
Muchas agallas inducidas por insectos son
coloreadas en algún momento de su ciclo
vital, aunque el rol específico de esta colo-
ración ha sido motivo de controversia entre
investigadores (White, 2010; Steyn et al.,
2002)
Además, las agallas son sumideros de fo-
toasimilatos y tienden a tener un cacter
heterótrofo dentro de la planta debido a la
acción del insecto inductor. Por esta razón
suelen tener alteraciones en su contenido de
clorofila y carotenoides (Huang et al., 2011
y 2014; Castro et al., 2012).
El objetivo de este trabajo es conocer la
variación en el contenido de clorofila a, clo-
rofila b, carotenos y antocianos en agallas
verdes, rojas y hojas sanas y, en el caso de los
antocianos, conocer su ubicación anatómica
y la naturaleza qmica del aglicón mayorita-
rio y de esta manera establecer las funciones
que cumplirían estos compuestos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material recolectado
ARGENTINA. Prov. Buenos Aires, Partido
de Zárate, -34.087237S -59.028389º, 0 m
snm, 07-II-2017, BAF IJA002. Se identificó
el material en base a las guías taxonómicas
de Cabrera (Cabrera y Zardini, 1978).
c
uantificación de clorofila a,
clorofila b y carotenoides
Se analizó el contenido de clorofila a, b y
carotenoides, a partir de extractos elabora-
dos con 1 gramo de material fresco en 100
93
Lilloa 54 (2): 91100, 7 de diciembre de 2017
ml de acetona 80%, por el método espec-
trofotométrico de Lichtenthaler y Wellburn
(1983).
c
uantificación de antocianos
Se realizó mediante la técnica de cuan-
tificación por espectroscopía diferencial, se-
gún una modificación de la técnica de Lee y
colaboradores (Lee et al., 2008). Se elaboró
un extracto de material fresco al 1% con
metanol: ácido clorhídrico (100:0.1). Bre-
vemente, a una alícuota del extracto (100
µl) se le adicio una solucn buffer KCl
pH 1,0 (1900 µl). Se realizaron las lecturas
a 520 nm y 700 nm. Luego se efectuaron
nuevamente las lecturas en buffer acetato
de sodio pH 4,5 (100 µl de extracto en 1900
µl de buffer). Se calcularon las diferencias
de absorbancia: (A520 nm – A700 nm)pH1
– (A520 nm – A700 nm) pH 4,5. Se expresó
el contenido de antocianos como antocianos
totales equivalentes a cianidina-3-glucósido
(ug de cianidina-3-glucósido/g material fres-
co).
c
aracterización
de
las antocianidinas
Se elaboró un extracto al 1% de material
fresco con metanol: ácido clorhídrico (99:1)
como solvente, el cual fue llevado a seque-
dad bajo corriente de nitrógeno. El residuo
se redisolvió en 5 mL de HCl 2N y se llevó
posteriormente a 100° C en un baño de agua
durante una hora. Los antocianos se hidroli-
zan y se liberan antocianidinas, las que son
extrdas con alcohol amílico. Se aislaron
estas agliconas mediante cromatografía en
capa delgada (TLC y HPTLC) de celulosa
de la fracción amílica, en los solventes Fo-
restal (ácido acético-ácido clorhídrico-agua,
30:3:10) y rmico (ácido rmico- ácido
clorhídrico-agua, 5:2:3). Se realizaron cro-
matograas en TLC y HPTLC de celulosa
empleando distintos solventes: Fórmico,
Forestal y BAA (butanol-ácido acético-agua,
6:1:2), frente a un testigo de cianidina. Tam-
bién se emplearon métodos de espectrosco-
a UV-visible; se obser el espectro del
extracto empleado para la cuantificación de
antocianos.
a
nálisis estastico
Se analizaron las diferencias entre ór-
ganos y entre individuos mediante el test
de Tukey empleando el software embebido
open source en la página web http://astat-
sa.com/OneWay_Anova_with_TukeyHSD/.
Se estableció la significancia estadística en
p<0.05.
u
bicación histológica
de
antocianos
Se realizaron cortes a mano alzada sin
ningún tipo de tratamiento para conocer la
ubicación de los pigmentos caracterizados.
RESULTADOS
Las agallas verdes, rojas y frutos maduros
se encuentran en las figs. 1, 2 y 3 respectiva-
mente. Los resultados de las mediciones se
encuentran en los gráficos 1 y 2; en todos los
casos observados las diferencias observadas
en todas las mediciones fueron estadística-
mente significativas.
La anatomía de las agallas rojas (Fig. 4),
agallas verdes (Fig. 5 y 6) y hojas sanas (Fig.
7 y 8), se observa que todos los órganos tie-
nen cloroplastos, pero que únicamente la
agalla roja tiene pigmentos de color rojo
ubicados en la epidermis externa.
Los resultados observados en los croma-
togramas (Fig. 9 y 10) y en el análisis espec-
troscópico UV del extracto a cuantificar (Fig.
10 y 11) señalan la presencia de cianidina
en el hidrolizado; en este último ensayo se
observa un pico de absorbancia a 536 nm.
DISCUSIÓN
La disminución en el contenido de clo-
rofilas totales y la ausencia de parénquima
en empalizada dan en la agalla idea de una
función fotosintética disminuida. Las agallas
forman sumideros de fotoasimilatos, que se-
rían empleados para mantener la estructura
y como fuente de energía para el insecto.
Sin embargo, se han reportado agallas con
características similares pero que tienen ta-
sas de fotosíntesis similares a las hojas sa-
nas (Oliveira et al., 2011; Fernandes et al.,
94
I. Agudelo et al.: Variación en el contenido de pigmentos en agallas inducidas por Neolithus
2010). De acuerdo a lo propuesto por otros
autores, la fotosíntesis de la agalla, por pe-
queña que fuera, independizaría aunque sea
parcialmente a los huéspedes de los fotoasi-
milatos producidos por las estructuras sanas,
y reduciría la competencia entre individuos
por estos recursos (Haiden et al., 2012).
Si bien existen numerosas hipótesis res-
pecto del color de las agallas, la ubicacn
epidérmica de estos pigmentos indicaría una
función o funciones relacionadas con la in-
teracción con factores abióticos y bióticos
en vez de un rol de protección del mesofilo.
Los resultados obtenidos en este estudio de-
muestran que el color de las agallas inducidas
por Neolithus spp. sobre S. haematospermum
es producido principalmente por glicósidos
de cianidina, dada la coincidencia entre el
espectro observado y el reportado por Har-
borne (1973) y Markham (1982) para esta
sustancia. Esta antocianidina es una de las
más frecuentes en el reino vegetal y en esta
Gráfico 1. Contenido de clorofila a y b, clorofila total y carotenoides totales en agalla roja,
agalla verde y hoja sana.
Gráfico 2. Contenido de antocianos totales en agalla verde, roja y hoja sana.
95
Lilloa 54 (2): 91100, 7 de diciembre de 2017
Fig. 1. Sapium haematospermum. Agalla verde.
Fig. 2. Sapium haematospermum. Agalla roja.
96
I. Agudelo et al.: Variación en el contenido de pigmentos en agallas inducidas por Neolithus
Fig. 3. Sapium haematospermum. Fruto con semillas coloreadas.
Fig. 4. Epidermis externa de agallas rojas
(200X).
Fig. 5. Epidermis externa de la agalla verde
(200X).
Fig. 6. Epidermis interna de la agalla verde
(200X).
F i g . 7 . A n at o mí a fo l ia r de h oj a sa n a
(200X).
97
Lilloa 54 (2): 91100, 7 de diciembre de 2017
interacción podría tener un rol aposemático
debido a que las semillas de este árbol son
rojas también. Como se mencionó antes, es-
tos pigmentos suelen tener un rol relacionado
con la antioxidación y se ha postulado que
poseerían propiedades protectoras contra el
estallido oxidativo y la fotoinhibición (Agati
et al., 2012). En este caso puntual, si existie-
ra un rol relacionado con la inhibición de la
fotosíntesis sería razonable ver un incremen-
to en la cantidad de carotenos, que también
poseen un rol antioxidante. A pesar de esto,
la configuración ortodihidroxi en el anillo B
tiene un poder antioxidante mayor que los
análogos monohidroxilados; la radiación UVB
Fig. 8. Haz central de la hoja sana (50X).
Fig. 9. TLC del hidrolizado de la agalla roja
(FE: Celulosa, FM: Forestal).
Fig. 10. TLC del hidrolizado de la agalla roja
(FE: Celulosa, FM: Fórmico).
98
I. Agudelo et al.: Variación en el contenido de pigmentos en agallas inducidas por Neolithus
Fig. 11. Espectro UV del extracto cuantificado.
suele aumentar la producción de compuestos
polifenólicos con esta configuración (Vande-
rauwera, 2005; Halbwirth, 2010).
Cabe destacar que estudios ecológicos
previos indican que las semillas son consu-
midas por pájaros de diversas familias como
Emberizidae y Tyrannidae (Peña y Pensiero,
2003); esto le resta fuerza a la hipótesis del
aposematismo, a pesar de la notable simili-
tud entre las semillas exhibidas por el fruto
abierto dehiscente y las agallas rojas. Qui-
zás este aposematismo no esté relacionado
con la herbivoría sino con la acción de hi-
menópteros parasitoides, y los glicósidos de
cianidina enmascaren la agalla frente a estos
predadores.
Otro posible rol está relacionado con la
capacidad de bloquear la radiación UV. Al-
gunos autores señalan que ciertos sistemas
de agallas inducidas por psílidos son rojos
mientras el inductor es joven, y se vuelven
verdes en la madurez del insecto (Dias et al.,
2013). No debe descartarse que este com-
puesto polifenólico coloreado tenga numero-
sas funciones durante un período específico;
la absorción de longitudes de onda dañinas
para las ninfas durante estadíos larvales tem-
pranos disminuiría la mortalidad y mejora-
ría la performance de los futuros adultos. La
presencia de este pigmento específicamente
en la epidermis brinda sustento a esta hi-
pótesis.
Son necesarios estudios de ecogicos
para conocer el impacto de la herbivoría y
el parasitoidismo sobre las agallas rojas, ver-
des y las semillas de S. haematospermum, a
como estudios de naturaleza química para
conocer el contenido de metabolitos prima-
rios y secundarios de estas estructuras y de
naturaleza anatómica e histoquímica para
saber si existen diferencias en el desarrollo
de haces vasculares y tubos laticíferos, ya
que los primeros son importantes para la nu-
trición de las ninfas y los segundos tienen
una función defensiva frente a predadores.
Schneeberger ha realizado un trabajo pio-
nero al respecto, que debería ser ampliado
para conocer los gradientes histoquímicos de
metabolitos primarios y secundarios.
CONCLUSIONES
Las agallas inducidas por Neolithus spp.
sobre S. haematospermum son deficientes en
99
Lilloa 54 (2): 91100, 7 de diciembre de 2017
clorofila y carotenos aunque son necesarios
estudios de tasa fotosintética para determi-
nar en qué grado estas estructuras actúan
como sumidero de fotoasimilatos; las agallas
de color rojo tienen presencia de glicósidos
de cianidina, que cumplirían un rol en la de-
fensa de la agalla frente a predadores exter-
nos y condiciones ambientales adversas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer al Lic. Ni-
colás Kuzmanich del Centro de Investigacio-
nes Entomogicas de Córdoba (rdoba,
Argentina) por su apoyo bibliográfico. Este
trabajo fue financiado con un subsidio UBA
20020130100641BA (Programación Cientí-
fica 2014-2017).
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