Lilloa 52 (2): 161–174, 2015
161
Ricco, Rafael A.; Ignacio J. Agudelo; Marcelo L. Wagner*
Cátedra de Farmacobotánica. Departamento de Farmacología. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad
de Buenos Aires. Junín 956, (C1113AAB) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, República Argentina.
* Autor corresponsal: mlwagner@ffyb.uba.ar
Recibido: 06/08/15 – Aceptado: 30/09/15
Métodos empleados en el análisis de los polifenoles
en un laboratorio de baja complejidad
Resumen — Ricco, Rafael A.; Ignacio J. Agudelo; Marcelo L. Wagner. 2015. “Métodos
empleados en el análisis de los polifenoles en un laboratorio de baja complejidad”. Lilloa 52
(2). Los polifenoles son el grupo de compuestos provenientes del metabolismo secundario
más estudiados. Abarcan una amplia variedad de moléculas que contienen al menos un anillo
aromático con uno o más grupos hidroxilos en su estructura. Son metabolitos secundarios
que participan en la defensa química de las plantas contra los depredadores y en las interac-
ciones alelopáticas. Además, se les adjudican una amplia variedad de actividades biológicas,
muchas de las cuales están asociadas con su acción antioxidante. La dinámica de los polife-
noles estudia la modificación cuali-cuantitativa de los polifenoles en las plantas en respuesta
a las interacciones con factores bióticos o abióticos, como así también, las modificaciones
producidas por los cambios fenológicos y ontológicos. El objetivo del trabajo es introducir las
técnicas de análisis de los polifenoles presentes en las plantas para estudios de ecología
química o para ser empleados, por ejemplo, en el control de calidad de plantas medicinales.
Estos procedimientos incluyen métodos para el estudio de fenoles totales y para cada tipo de
compuestos fenólicos que puedan ser realizados en laboratorios de baja complejidad.
Palabras clave: cuantificación; dinámica; fenoles; taninos.
Abstract — Ricco, Rafael A.; Ignacio J. Agudelo; Marcelo L. Wagner. 2015. “Methods
used in the analysis of polyphenols in a low complexity laboratory”. Lilloa 52 (2). Polyphenols
are the most studied group of compounds from secondary metabolism. They compromise a
broad variety of molecules that contain at least one aromatic ring with one or more hydroxyl
group in their structure. They are secondary metabolites that participate in the chemical
defense of plants against predators, and allelopathic interactions. Furthermore, a wide vari-
ety of biological activities are awarded to them, many of which are associated with their
antioxidant action. Polyphenols dynamics studies the quali-quantitative modification of polyphe-
nols in plants in response to interactions with biotic or abiotic factors, as well as, modifica-
tions made by phenological and ontological changes. The aim of this work is to introduce the
analysis techniques of polyphenols present in plants for the study of chemical ecology, or to
be employed, for instance, in the quality control of medicinal plants. These procedures in-
clude methods for the study of total phenols and for each type of phenolic compounds that
can be made in low complexity laboratories.
Keywords: Dynamics; phenols; quantification; tannins.
INTRODUCCIÓN
¿POR QUÉ ESTUDIAR LOS POLIFENOLES
DE LAS PLANTAS?
Hay muchas razones para investigar los
polifenoles de las plantas. Desde las estructu-
ras más sencillas, hasta las más complejas,
los polifenoles exhiben un rango muy varia-
do de propiedades bio-fisicoquímicas que
los hacen productos naturales únicos e intri-
gantes. Además, desde el punto de vista de
la salud humana, los polifenoles son micro-
nutrientes presentes en nuestra dieta y cum-
plen una función muy importante en la pre-
vención de enfermedades degenerativas, tales
como el cáncer, las enfermedades cardiovas-
culares, diabetes, osteoporosis y enfermeda-
des neurodegenerativas (Manach et al.,
2004; Cheynier, 2005; Pandey y Rizvi, 2009;
Habauzt y Morand, 2012; Arranz et al.,
2013; Mushtag y Wani, 2013; Biasutto et al.,
2014).
R. A. Ricco et al.: Métodos empleados en el análisis de los polifenoles
162
La segunda pregunta que surge es: ¿que
son los polifenoles? Edwin Haslam (1998)
define a los polifenoles como compuestos
solubles en agua, que tienen una masa mo-
lecular comprendida entre 500 y 3.000 a
4.000 Da y poseen de 12 a 16 grupos hi-
droxilos fenólicos sobre 5 o 7 anillos aromá-
ticos por cada 1.000 Da de masa molecular.
Además se caracterizan por dar positiva la
reacción de fenoles y precipitan los alcaloi-
des, la gelatina y otras proteínas en solu-
ción. Esta definición es conocida como WBS-
SH porque es producto de los trabajos de
Theodore White, Edgar Charles Bate-Smith,
Tony Swain y Edwin Haslam (Quideau et
al., 2011).
Por lo tanto, de acuerdo con la definición
hay tres clases de polifenoles: las proantocia-
nidinas (taninos condensados), los galo y
elagitaninos (taninos hidrolizables) y los flo-
rotaninos, estos últimos presentes en las al-
gas pardas. A los tres grupos se los clasifica
también con el término de «taninos» (Has-
lam, 1998; Lattanzio et al., 2008; Quideau
et al., 2011) (Fig. 1).
Sin embargo, existen otros grupos de fe-
noles, más o menos complejos, a los cuales
también se les adjudican el término de «poli-
fenoles». Por ejemplo: los flavonoides, los
ácidos hidroxicinámicos, los flobafenos (flo-
bataninos) y los estilbenos (Haslam, 1998;
Lattanzio et al., 2008; Quideau et al., 2011)
(Fig. 2).
Quideau et al. (2011) proponen que el
término de polifenoles sea utilizado para
definir los metabolitos secundarios derivados
exclusivamente de las vías metabólicas shi-
kimato-fenilpropanoide y/o policétidos, que
presenten más de un anillo fenólico y des-
provisto de nitrógeno en su estructura.
Fig. 1. Ejemplos representativos de las tres clases de polifenoles: las proantocianidinas (ta-
ninos condensados), los galo y elagitaninos (taninos hidrolizables) y los florotaninos.
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163
La tercera pregunta que surge es: ¿por qué
las plantas responden metabólicamente con
tanta variedad de moléculas fenólicas? La
respuesta a esta pregunta es aún un tema de
debate y especulación y posiblemente sea dife-
rente para los distintos tipos de polifenoles.
En general, a los polifenoles de las plan-
tas, como fueron definidos anteriormente, se
los han relacionado en diversos papeles, in-
cluyendo la resistencia de las plantas contra
microrganismos patógenos y animales herbí-
voros, como los insectos. Los polifenoles son
importantes, también, en la protección del
ADN frente a las radiaciones solares, en es-
pecial, la radiación UV-B, lo que probable-
mente fue un factor determinante en la evo-
lución de las plantas terrestres (Harbone y
Williams, 2000; Treutter, 2006; Lattanzio et
al., 2008; Quideau et al., 2011).
En el curso de la evolución a largo pla-
zo, así como a los rápidos cambios estacio-
nales, las plantas han aprendido a hacer
frente a las cambiantes condiciones del me-
dio y a las presiones ambientales, apoyándo-
se, a través de su dinámico metabolismo se-
cundario, en su arsenal químico.
Entre los principales grupos de metaboli-
tos secundarios, como los alcaloides y los
compuestos terpénicos, los polifenoles han
demostrado su valor en la protección de las
plantas durante la evolución, al tiempo que
contribuyen a mantener un equilibrio ecoló-
gico, por encima y por debajo del suelo, en-
tre las plantas y otros organismos vivos,
muchos de los cuales se alimentan de ellas,
incluyendo el hombre (Quideau et al.,
2011).
Por otro lado, una característica del me-
tabolismo de las plantas es la flexibilidad
para acomodar cambios en el desarrollo
(metabolismo primario) para responder a
cambios del ambiente (metabolismo secun-
Fig. 2. Ejemplos representativos de flavonoides, ácidos hidroxicinámicos y estilbenos.
R. A. Ricco et al.: Métodos empleados en el análisis de los polifenoles
164
dario). En un período relativamente corto se
producen modificaciones en los metabolitos
secundarios como respuesta al estrés produ-
cido por las interacciones con factores bióti-
cos o abióticos (Lattanzio et al., 2008).
La dinámica de los polifenoles estudia la
modificación cuali-cuantitativa de los polife-
noles en las plantas en respuesta a las inte-
racciones de la planta con factores bióticos
o abióticos, como así también, las modifica-
ciones producidas por los cambios fenológi-
cos y ontológicos.
El objetivo del trabajo es introducir las
técnicas de análisis de los polifenoles presen-
tes en las plantas. Estos procedimientos in-
cluyen métodos para el estudio de fenoles
totales y para cada tipo de compuesto fenó-
lico que puedan ser realizados en laborato-
rios de baja complejidad.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. DE LA PLANTA AL EXTRACTO
El problema general que se presenta en el
análisis de la dinámica de polifenoles está
relacionado en la naturaleza misma del
material objeto del análisis. En los estudios
de ecología bioquímica se trata normalmen-
te de tejidos vivos que serán sometidos a di-
versos procedimientos, dando como resulta-
do final la obtención de un extracto.
El objetivo de la preparación de un ex-
tracto es la transferencia de los diversos
compuestos presentes en el material vegetal
a una solución, evitando todo aquello que
pueda modificar su composición cuali-cuan-
titativa. Es decir, el extracto debería repre-
sentar la composición fisiológica (normal-
mente estado vivo) presente en el material
objeto de análisis.
La preparación de un extracto puede ser
dividida en tres partes:
1º. Recolección y preservación del mate-
rial vegetal;
2º. Preparación de las muestras a anali-
zar (involucra todos aquellos procedi-
mientos previos a la extracción) y
3º. Extracción.
1.1. Recolección del material vegetal.— La
recolección del material vegetal constituye el
punto de partida de una larga serie de even-
tos que nos permitirán conocer la composi-
ción cuali-cuantitativa del material en estu-
dio. Es así que cobra importancia el trata-
miento posterior a la recolección del mate-
rial vegetal, con el objeto de evitar cambios
en dicha composición.
En la siguiente tabla se presentan diver-
sas posibilidades de recolección del material
a analizar, presentados en orden decreciente,
constituyendo la disponibilidad de material
fresco en el laboratorio (invernadero) como
la situación ideal (Waterman y Mole, 1994):
1. Llevar el material vivo al laboratorio.
2. Colocar el material fresco en nitróge-
no líquido (en el campo).
3. Al material fresco congelarlo o liofili-
zarlo cerca del lugar de colección.
4. Al material fresco trasladarlo en hielo
durante 3 o 4 horas antes de procesarlo.
5. Las muestras secadas en hornos con
ventilación forzada a 60 ºC.
6. Las muestras secadas directamente,
sin condiciones controladas.
7. Las muestras transportadas sin ningún
cuidado.
1.2. Extracción.— El objetivo de la extrac-
ción es la remoción de los compuestos fenó-
licos presentes en el material vegetal, obte-
niendo una solución rica en dichos metaboli-
tos. La elección del solvente adecuado repre-
senta un punto clave en el análisis de los
compuestos fenólicos, donde el solvente más
empleado es el MeOH 50 %, constituyendo
el MeOH 80 % y la acetona 70 % otros sis-
temas eficaces y adecuados a las necesidades
del análisis.
Una vez elegido el solvente, la extracción
puede llevarse a cabo a temperatura ambien-
te (25 ºC), empleando solvente fresco en ex-
tracciones repetidas, usando un agitador or-
bital que permita un buen contacto entre el
material vegetal y el solvente. Posteriormen-
te, un proceso de filtración permitirá obtener
un extracto adecuado para el análisis cuan-
titativo.
Lilloa 52 (2): 161–174, 2015
165
2. ESTUDIOS CUALITATIVOS
2.1. Perfil bidimensional de los polifeno-
les.— Se realiza por medio de cromatogra-
fías bidimensionales en capa delgada de ce-
lulosa, según metodología estándar (Mabry
et al., 1970; Markham, 1982).
Para el análisis de los flavonoides y áci-
dos hidroxicinámicos se emplea el sistema de
solventes TBA (terbutanol-ácido acético-
agua, 3:1:1) para la primera dimensión y
ácido acético 15 % para la segunda dimen-
sión. Los cromatogramas se observan a la
luz ultravioleta antes y después de ser ex-
puestos a vapores de amoníaco y, posterior-
mente, se revela con el reactivo de productos
naturales (NP 1 % en metanol) (Wagner y
Bladt, 1996).
Para el estudio de las proantocianidinas
(taninos condensados) se realiza cromato-
grafías bidimensionales empleando como
sistema de solventes secBAA (butanol secun-
dario-ácido acético-agua, 6:1:2) para la pri-
mera dimensión y ácido acético 6 % para la
segunda dimensión. Se emplea como revela-
dor el reactivo de vainillina-ácido clorhídri-
co (vainillina al 5 % en etanol-ácido clorhí-
drico concentrado, 4:1), con posterior calen-
tamiento (5 min a 100 ºC) (Markham,
1982).
3. ESTUDIOS CUANTITATIVOS
3.1. Cuantificación de fenoles totales.— En-
tre las mediciones realizadas en estudios de
química ecológica, la determinación del
contenido total de compuestos fenólicos ocu-
pa un lugar preponderante. Las técnicas
empleadas permiten cuantificar el contenido
de hidroxilos fenólicos presentes en el mate-
rial a analizar (extractos), independiente-
mente de la naturaleza de cada componente
presente.
En la actualidad, la cuantificación de los
fenoles totales es llevada a cabo mediante
dos técnicas: el método de Folin-Ciocalteu (el
más empleado) y el método de Price y Butler.
Ambos métodos se fundamentan en reaccio-
nes de óxido reducción.
En el método de Folin-Ciocalteu, el ión
fenolato es oxidado (en medio alcalino)
mientras que el reactivo fosfotúngstico-mo-
líbdico es reducido, formando un complejo
color azul (cromóforo).
En el método de Price y Butler, también
el ión fenolato es oxidado mientras que el
ion férrico (Fe
3+
) es reducido a ión ferroso
(Fe
2+
) que se detecta mediante la formación
de un complejo azul con el reactivo ferricia-
nuro de potasio. El complejo formado de fór-
mula Fe
4
[Fe(CN)
6
]
3
se conoce con el nombre
de azul de Prusia.
3.1.1. Método de Folin–Ciocalteu (Makkar et
al., 1993).— Una alícuota (50 - 100 µl) del
extracto es transferida a un tubo de ensayos
y el volumen se lleva a 500 µl con agua de-
sionizada. Se adicionan a continuación 250
µl de reactivo de Folin-Ciocalteu y 1,25 ml
de solución acuosa de carbonato de sodio al
20 %. Luego de 40 minutos se mide la ab-
sorbancia a 725 nm. El contenido de fenoles
totales se expresa como equivalentes de áci-
do tánico (ATE, mg ácido tánico / g material
seco) o equivalentes de ácido gálico (GAE,
mg ácido gálico / g material seco).
Para confeccionar la curva de calibra-
ción se utiliza una solución madre de ácido
tánico o ácido gálico (0,1 mg / ml). Las
concentraciones finales que se usan para el
ácido tánico van de 1 µg / ml hasta 5 µg /
ml. En el caso del ácido gálico el rango que-
da comprendido entre 1 µg / ml hasta 10 µg
/ ml.
3.1.2. Método de Price y Butler (Price y But-
ler, 1977).— Se toma 250 µl del extracto y
se le adicionan 25 ml de agua desionizada,
seguido de 3 ml de cloruro férrico 0,1 M.
Luego de 3 min se agregan 3 ml de ferricia-
nuro de potasio 8 mM y se mezcla. Después
de 15 min se lee la absorbancia a 720 nm.
El contenido de fenoles totales se expresa
como equivalentes de ácido tánico (ATE, mg
ácido tánico / g material seco) o equivalen-
tes de ácido gálico (GAE, mg ácido gálico /
g material seco).
El ensayo se estandariza con una solu-
ción madre de 0,01 M de ácido gálico (188
µg / ml).
R. A. Ricco et al.: Métodos empleados en el análisis de los polifenoles
166
3.2. Cuantificación de taninos
3.2.1. Cuantificación de taninos totales (Mé-
todo I).— El método se basa en la propie-
dad de los taninos de precipitar las proteí-
nas. El ensayo consta de tres etapas, en la
primera se realiza la determinación de los
fenoles totales por el procedimiento de Fo-
lin-Ciocalteu.
En la segunda etapa se remueven los ta-
ninos mediante su precipitación con una so-
lución de seroalbúmina bovina (BSA) (buffer
acetato 0,2 M, pH 5,0; cloruro de sodio
0,17 M y 1,0 mg/ml de la fracción V de
BSA). Para lograrlo, a 1 ml del extracto se
le adiciona 1 ml de solución de BSA. Luego
de 15 min a temperatura ambiente, se centri-
fuga a 5.000 rpm.
Finalmente el tercer paso es determinar
sobre una alícuota del sobrenadante (50 -
100 µL) la concentración de fenoles por el
procedimiento de Folin-Ciocalteu.
Al valor obtenido de fenoles totales se le
resta el valor de fenoles obtenidos posterior-
mente a la precipitación con BSA, de esta
manera se obtiene el valor de fenoles que se
comportan como taninos (taninos totales).
El contenido de taninos totales se expresa
como equivalentes de ácido tánico (ATE, mg
ácido tánico / g material seco) o equivalen-
tes de ácido gálico (GAE, mg ácido gálico /
g material seco). Se emplea la misma curva
que se utiliza en la determinación de fenoles
totales.
3.2.2. Cuantificación de taninos (Método II)
(Waterman y Mole, 1994).— Se toma 1 ml
de muestra y se agrega 2 ml de una solu-
ción de BSA (buffer acetato 0,2 M, pH 5,0;
cloruro de sodio 0,17 M y 1,0 mg/ml de la
fracción V de BSA), se mezcla y se deja a
temperatura ambiente durante 15 min. La
suspensión se centrifugada a 5.000 rpm y se
descarta el sobrenadante. Se lava el precipi-
tado con buffer acetato 0,2 M, pH 5,0 y se
resuspende en SDS (solución acuosa que con-
tiene 1 % p/v de dodecil sulfato de sodio,
5 % v/v de trietanolamina y 20 % v/v de is-
propanol). Luego se agrega 1 ml del reactivo
cloruro férrico (0,01 M de FeCl
3
en 0,01 N de
HCl), se mezcla, se espera 15 a 30 min y se
mide la absorbancia a 510 nm.
Se construye una curva de calibración
utilizando ácido tánico o quebracho tanino
purificado o el tanino purificado proveniente
de la especie en estudio.
3.2.3. Método de difusión radial para tani-
nos (Waterman y Mole, 1994).— Prepara-
ción de las placas de agar-BSA: Se prepara
una solución al 1% (p/v) de agarosa en el
siguiente buffer: 50 mm de ácido acético, 60
µM ácido ascórbico y se ajusta el pH a 5,0
con NaOH. El buffer se lleva a 100 °C para
disolver la agarosa. Se enfria a 45 °C y se
agrega la seroalbúmina bovina a una con-
centración de 0,1% p/v. Verter alícuotas de
10 ml dentro de cajas de Petri de 9 cm de
diámetro y se deja enfriar a 4 ºC. Se cortaron
discos de 4 mm de diámetro con un sacabo-
cados.
Ensayo: Se colocan 10 µl de los extractos
en los huecos. Para elaborar la curva de cali-
bración se utilizan soluciones estándares de
ácido tánico (10 mg / ml hasta 50 mg / ml).
Se sellan las cajas de Petri con Parafilm® y se
incuban a 30 ºC durante 96-120 h.
Una vez que se generaron los anillos de
precipitación se miden, para cada muestra,
dos diámetros perpendiculares entre sí y lue-
go se utiliza el cuadrado del diámetro pro-
medio y se intercala en la curva de calibra-
ción para determinar la concentración de los
taninos presentes.
3.3. Cuantificación de taninos condensados
(Proantocianidinas)
3.3.1. Método de la proantocianidina (Porter
et al., 1986).— El método se basa en la des-
polimerización en medio ácido de los tani-
nos condensados, como producto se origina
las antocianidinas, compuestos coloreados
que pueden ser cuantificados espectrofotomé-
tricamente.
Se toman alícuotas de 0,50 ml del extrac-
to y se transfieren a tubos de ensayos y se
agregan 3,0 ml del reactivo butanol-HCl
(butanol-HCl, 95:5 v/v) y 0,1 ml de reactivo
férrico (2 % sulfato férrico-amónico en HCl
Lilloa 52 (2): 161–174, 2015
167
2 M). Mezclar y colocar los tubos en baño
María a ebullición durante 60 min. Luego
de enfriarlos, se miden las absorbancias a
550 nm contra un blanco. El contenido en
proantocianidinas se expresa como densidad
óptica (D.O.) a 550 nm.
3.3.2. Método de la vainillina (Price et al.,
1978).— El ensayo involucra la reacción de
un aldehído aromático, la vainillina, con el
anillo A de los flavan-3-ol originando un
aducto de color rojo (Hagerman, 2002).
Reactivo de la vainillina: Realizar dos so-
luciones, una solución metanólica al 8 % de
HCl concentrado y la otra solución metanó-
lica al 1 % de vainillina. El reactivo se pre-
para mezclando igual cantidad de esas solu-
ciones, de manera tal que queda una solu-
ción metanólica de 4 % de HCl y 0,5 % de
vainillina. Se prepara en el momento en que
se va usar.
Procedimiento: La muestra (100 % en
metanol) y el reactivo deben estar a 30 ºC
antes de comenzar en ensayo. A tiempo cero
agregar 1 ml de la muestra a 5 ml de reacti-
vo y mezclar. Mantener el ensayo a 30 ºC
durante 20 min. Medir la absorbancia a 500
nm.
Blanco de la reacción: Realizar un «blan-
co de reactivo» para lo cual se prepara una
solución al 4 % de HCl en metanol.
Curva de calibración: Se construye la
curva de calibración (Absorbancia vs mg de
catequina) a partir de una solución 0,3 mg
/ ml de catequina.
3.4. Cuantificación de taninos hidrolizables
3.4.1. Galotaninos. Método de la rodani-
na.— El método consiste en la hidrólisis de
los galotaninos en condiciones anaeróbicas,
el ácido gálico reacciona con la rodanina
originando un cromóforo de color rosado
(Inoue y Hagerman, 1988).
Preparación de la muestra: Mezclar 5 ml
de una solución 1 M de H
2
SO
4
y 1 ml de
muestra (en 70 % de acetona) en tubo de
ensayo con rosca. Se puede proceder de dos
maneras, se realiza vacío y se guarda el con-
tenido congelado o se desplaza el oxígeno
por ventilación con nitrógeno. Se calienta el
tubo sellado durante 26 h a 100 ºC. Enfriar,
llevara a 50 ml de volumen con agua desio-
nizada.
Procedimiento: A tiempo cero mezclar 1
ml de muestra y 1,5 ml de reactivo (0,667 %
de la solución metanólica de rodanina). Des-
pués de exactamente 5 min agregar 1 ml de
0,5 M de KOH. Esperar 2,5 min y diluir con
agua hasta tener 25 ml, mezclar antes de
leer la absorbancia a 520 nm después de 5-
10 min. Los resultados se expresan como
equivalentes de ácido gálico
La curva de calibración se realiza por
medio de una solución madre de ácido gáli-
co (0,10 mg / ml en 0,2 N H
2
SO
4
). Se utili-
za entre 0,2 y 1 ml de la solución madre de
ácido gálico en la construcción de la curva.
3.4.2. Elagitaninos. Método de Bate-Smith
(Waterman y Mole, 1994).— Mezclar 2 ml de
muestra (extracto crudo en metanol 50 %)
con 160 µl de ácido acético acuoso al 6 % en
una cubeta y remover el oxígeno de la mezcla
mediante burbujeo suave de una corriente de
nitrógeno durante 15 min. Posteriormente se
agrega 160 µl de reactivo (nitrito de sodio al
6 % en agua) y sobre la superficie dejar pasar
una corriente de nitrógeno durante 15 min.
Tapar la cubeta con teflón y leer la absorban-
cia a 600 nm después de 1 h.
Se utiliza una solución madre de 1 µg /
ml de ácido gálico en dimetilsulfóxido
3.5. Cuantificación de flavonoides.— Los
métodos que se describen se basan en la for-
mación de complejos coloreados entre los
hidroxilos fenólicos y el grupo ceto de los
flavonoides con el tricloruro de aluminio o
el 2-aminoetil difenilborato (Ho et al.,
2012).
Curva de calibración: La curva de cali-
bración se realiza con soluciones metanólica
de rutina de 1,000 mg / ml, 0,500 mg / ml,
0,250 mg / ml, 0,125 mg / ml, 0,0625 mg /
ml. De acuerdo con la técnica empleada se
utilizarán las concentraciones que permitan
una relación lineal entre la absorbancia y la
concentración.
R. A. Ricco et al.: Métodos empleados en el análisis de los polifenoles
168
3.5.1. Modificación de la técnica de Maksi-
movic et al. (2005).— A 0,1 ml del extracto
se le adicionan 1,4 ml de agua desionizada
y 0,50 ml del reactivo de flavonoides
(133 mg tricloruro de aluminio, 400 mg
acetato de sodio en 100 ml de solvente cons-
tituido por 140 ml metanol, 50 ml agua, 10
ml ácido acético). Luego de 5 min a tempe-
ratura ambiente, se mide la absorbancia a
430 nm.
Se realiza una curva de calibración con
rutina. El contenido de flavonoides se expre-
sa como equivalentes de rutina (RE, mg ruti-
na / g material seco).
3.5.2. Adaptación de las técnicas de Woisky y
Salatino y Chang et al. (Woisky y Salatino,
1998; Chang et al., 2002).— 0,5 ml del ex-
tracto se mezcla con 1,5 ml de etanol 95 %.
Se agrega posteriormente 0,1 ml de una so-
lución acuosa de tricloruro de aluminio al
10 % (p/v) y 0.1 ml de una solución acuosa
1 M de acetato de sodio. Se lleva a un volu-
men final de 5 ml con agua destilada y la
mezcla se deja reposar por 30 min. Poste-
riormente se determina la absorbancia a
415 nm. Se realiza una curva de calibración
con rutina. El contenido de flavonoides se
expresa como equivalentes de rutina (RE,
mg rutina / g material seco).
3.5.3. Técnica de Shohael et al. (2006).— A
una alícuota del extracto se le adiciona 1,25
ml de agua desionizada y 75 µl de una solu-
ción acuosa de NaNO
2
(5 % p/v). La mezcla
se agita con un mezclador de vórtice y se
incuba a temperatura ambiente durante 6
min. Luego se añade 150 µl de una solución
acuosa de AlCl
3
(10 % p/v) y, después de 5
min, se agrega 0,5 ml de una solución acuo-
sa 1 M de NaOH y 2,5 ml de agua desioni-
zada. Finalmente, la mezcla se incuba du-
rante 30 min a temperatura ambiente y se
mide la absorbancia a 510 nm utilizando
metanol como blanco. Los valores se expre-
san como equivalentes de quercetina (QE,
mg de quercetina / g material seco) o como
equivalentes de rutina (RE, mg rutina /lg
material seco).
3.5.4. Adaptación de las técnicas de Jia et al.
y Yoo et al.— Se agrega a 1 ml del extracto
a analizar 4 ml de agua destilada y 0,3 ml
de una solución acuosa de nitrito de sodio
al 5 % (p/v). Luego de 5 min de reacción, se
agregan 0,6 ml de una solución acuosa de
tricloruro de aluminio al 10 % (p/v). Luego
de 6 min, se agregan 2 ml de una solución
acuosa 1 M de hidróxido de sodio y agua
destilada hasta llegar a un volumen de 10
ml. La mezcla es centrifugada a 3.000 rpm
durante 3 min, y la absorbancia del sobre-
nadante se mide a 510 nm. Se realiza una
curva de calibración con quercetina. Los va-
lores se expresan como equivalentes de quer-
cetina (QE, mg de quercetina / g material
seco). Todas las mediciones se efectúan por
triplicado.
3.5.5. Técnica adaptada de Hariri et al.
(1991).— A 2 ml del extracto se mezcla con
100 µl de una solución metanólica al 1 %
(p/v) del reactivo 2-aminoetil difenilborato.
Luego de 20 min a temperatura ambiente, se
determina la absorbancia a 404 nm. Los va-
lores se expresan como equivalentes de ruti-
na (RE, mg rutina / g material seco).
3.6. Cuantificación de ácidos hidroxiciná-
micos totales. Modificación del método de
Dao y Friedman (1992).— Alícuotas de 50 µl
del extracto se lleva a volumen (2 ml) con
etanol absoluto. Se determina la absorban-
cia a 328 nm. Se realiza una curva de cali-
bración con ácido clorogénico (la concen-
tración final en el medio de reacción es de
0,0025 – 0,0150 mg / ml). Los valores se
expresan como equivalentes de ácido cloro-
génico (CA, mg de ácido clorogénico / g
material seco).
4. ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL
La elucidación de las estructuras de los
polifenoles no es un tema indispensable en
ecología química. Por otro lado, para reali-
zar la elucidación de las estructuras se re-
quiere de técnicas complejas, en donde el
equipamiento es muy costoso y, en general,
no se dispone en los laboratorios de baja
complejidad.
Lilloa 52 (2): 161–174, 2015
169
Entre las técnicas que se utilizan se en-
cuentran (Balas y Vercauteren, 1994; Kruger
et al., 2000; March y Brodbelt, 2008; Vukics
y Guttman, 2010):
– Espectroscopia de masa con ionización
por electrospray (ESI-MS),
– Mecanismos de fragmentación múltiple
en condiciones de espectrometría de masas
en tándem (CID MS),
– Espectrometría de masa en modalidad
de MALDI,
– Espectroscopía de resonancia magnéti-
ca nuclear (RMN), análisis
1
D y
2
D homo y
heteronuclear.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE LA
DINÁMICA DE LOS POLIFENOLES
Como se mencionó anteriormente, la pre-
sencia de compuestos fenólicos puede variar,
dentro de un individuo, en respuesta a facto-
res genéticos, ontogénicos, bióticos y abióti-
cos, afectando de diversa manera a los dife-
rentes órganos de la planta (Waterman y Mc
Key, 1989; Riipi et al., 2002; Del Baño et
al., 2002; Rugna et al., 2008).
Los polifenoles son compuestos que inter-
vienen activamente en la interacción planta-
insecto, regulando la performance de los
herbívoros (Haslam, 1988; Barbehenn y
Constabel, 2011). Entre los trabajos que se
realizan en nuestro laboratorio podemos co-
mentar los siguientes casos en donde se pue-
den apreciar las técnicas de estudio aplica-
das al estudio de la dinámica de polifenoles
en la interacción planta-insecto:
Schinus longifolius (Lindl.) Speg.
(Anacardiaceae), conocido con los nombres
vulgares de «molle», «incienso» y «trementi-
na», es un árbol o arbusto cuyas hojas, bajo
la forma de infusión, son empleadas como
expectorante y purgante en la medicina tra-
dicional. Es una especie que a menudo se
encuentra parasitado por insectos galígenos
de diversos órdenes, entre los que se encuen-
tra Calophya mammifex (Hemiptera - Calo-
phyidae). El análisis del perfil bidimensional
de los flavonoides y ácidos hidroxicinámicos
permite observar una variación de tipo cuali-
cuantitativo, determinada por una disminu-
ción de estos metabolitos en los extractos
provenientes de las agallas (Fig. 3). En el
análisis del perfil de proantocianidinas tam-
bién se observa una modificación cuali-
cuantitativa, pero en éste caso la agalla pre-
senta una alta concentración de proantocia-
nidinas acompañada de una mayor comple-
jidad de compuestos (monómeros y oligóme-
ros), respecto de lo observado para las hojas
sanas (Fig. 4) (Agudelo et al., 2013). Con
excepción de las proantocianidinas, se pudo
observar una disminución en los valores de
fenoles totales, taninos totales, flavonoides
totales y ácidos hidroxicinámicos totales en
las hojas que tenían agallas, respecto de las
sanas (Tabla 1) (Agudelo et al., 2013).
Tripodanthus acutifolius (Ruiz et Pav.)
Tiegh. (Loranthaceae) es una de las especies
comprendida dentro del grupo de los «muér-
dagos», que en su ambiente natural puede
infestarse con cochinillas, insectos con pie-
zas bucales perforadoras y chupadoras que
se alimentan de jugos vegetales, pertenecen
al orden Homópteros. Al comparar los poli-
fenoles de los individuos de T. acutifolius in-
festados con los individuos sanos se observan
modificaciones cuali-cuantitativas en el con-
Tabla 1. Cuantificación de fenoles totales, taninos totales, proantocianidinas, flavonoides to-
tales y ácidos hidroxicinámicos en hojas sanas y con agallas de Schinus longifolius. Los valo-
res expresados como media ± (SD).
R. A. Ricco et al.: Métodos empleados en el análisis de los polifenoles
170
tenido de los polifenoles. En las hojas infec-
tadas los polifenoles se elevan aproximada-
mente un 40 % respecto de las sanas. Los
niveles de taninos totales aumentan hasta un
130 % en los individuos infectados si se lo
compara con los individuos sanos. En las
hojas sanas, los taninos totales representan
aproximadamente el 15 % del total de feno-
les. En las hojas infectadas esta relación au-
menta hasta el 25 % (Tabla 2) (Ricco et al.,
2008).
Otro ejemplo lo constituye Smilax cam-
pestris Griseb. (Smilacaceae), especie que es
atacada por la oruga de la mariposa Agrau-
lis vanillae L. (Heliconidae). Si se comparan
los perfiles de polifenoles entre hojas sanas y
comidas, la concentración de fenoles totales
se triplica en las últimas, respecto de las
hojas sanas. En esta especie se pudo observar
que el aumento de los fenoles totales es a
expensas del aumento de la síntesis de flavo-
noides (Tabla 3) (Rugna et al., 2011).
Por otro lado, la concentración de com-
puestos fenólicos puede variar, en un indivi-
duo, en respuesta a factores ontogénicos,
afectando de diversa manera a los diferentes
órganos de la planta:
Estudios realizados en Aloysia citrodora
Palau (Verbenaceae) han demostrado una
clara diferencia en la concentración de poli-
fenoles en relación al grado de desarrollo
foliar, donde los principales polifenoles pre-
sentes en las hojas (ácidos hidroxicinámicos
y flavonoides), tienen mayor acumulación en
aquellas hojas que presentan una alta tasa
de crecimiento, es decir, en las hojas jóvenes.
Tabla 2. Valores de fenoles totales y taninos
totales en hojas sanas e infectadas de Tripo-
danthus acutifolius. Valores expresados como
la media ± (SD).
Tabla 3. Cuantificación de fenoles totales en
hojas sanas y atacadas de Smilax campes-
tris. Los valores expresados como la media
± (SD).
Fig. 3. Reacción con NP. Los compuestos celestes y verdes corresponden a los ácidos hi-
droxicinámicos. Los compuestos amarillo-anaranjados a los flavonoides.
Lilloa 52 (2): 161–174, 2015
171
Los niveles de polifenoles decrecen rápida-
mente con la edad de la hoja. Se ha obser-
vado que la concentración de los fenoles to-
tales en las hojas jóvenes es aproximadamen-
te un 90 % mayor respecto al contenido de
las hojas adultas. Los flavonoides totales son
un 20 % superior en las hojas jóvenes. Pero
el mayor aporte a los fenoles totales lo rea-
lizan los derivados del ácido hidróxicinámi-
co, donde la concentración en las hojas jóve-
nes es hasta aproximadamente 80 % supe-
rior respecto de la hojas adultas. Estos com-
puestos constituyen la principal diferencia
entre los perfiles obtenidos como así también
el principal aporte al contenido de fenoles
totales (Tabla 4) (Ricco et al., 2011 a).
Equisetum giganteum L. (Equisetaceae)
es una especie nativa de Sudamérica y Amé-
Tabla 4. Cuantificación de fenoles totales, taninos, flavonoides y ácidos hidroxicinámicos en
hojas jóvenes y adultas de Aloysia citrodora. Los valores expresados como media ± (SD).
Fig. 4. Reacción de la vainillina. Las proantocianidinas se observan de color púrpura.
rica Central, que es empleada en la medici-
na tradicional como diurético y en el trata-
miento de diversas patologías. El objetivo de
este trabajo fue estudiar el perfil de polifeno-
les presentes en las ramas laterales (tallos
finos), tallos entrenudos y tallos basales. El
análisis de los resultados permite establecer
una diferencia significativa entre los valores
obtenidos para las ramas laterales (tallos
finos) respecto de los tallos entrenudos y ta-
llos basales. Las concentraciones de todos
los metabolitos analizados son mayores en
las ramas laterales, seguido por los tallos
entrenudos y tallos basales. Estas variaciones
cuantitativas se ven acompañadas también
de una variación cualitativa, observándose
una mayor complejidad biosintética en las
ramas laterales, determinada por la presen-
R. A. Ricco et al.: Métodos empleados en el análisis de los polifenoles
172
cia de proantocianidinas, compuestos ausen-
tes en los otros materiales analizados. Estos
resultados permiten inferir una distribución
espacial particular de los taninos condensa-
dos (proantocianidinas) en E. giganteum (Ta-
bla 5) (Ricco et al., 2011 b).
CONCLUSIONES
Estos ejemplos corresponden a especies
utilizadas en la medicina popular y en la
elaboración de medicamentos herbarios. Por
lo tanto, el estudio de la dinámica de los
polifenoles, con técnicas sencillas, aporta
información que debería tenerse en cuenta
porque nos permitiría detectar variaciones
en los parámetros químicos que afectan la
calidad de la droga e incluso modificarían
su actividad biológica.
AGRADECIMIENTO
Los autores agradecen a la Universidad
de Buenos Aires por la provisión del subsi-
dio 20020130100641BA, que financia este
trabajo.
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