V. de los A. Páez et al.: Estudios meióticos en Agalinis fiebrigii y A. genistifolia
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Páez, Valeria de los A.; Aldo R. Andrada; Graciela E. Ruiz de Bigliardo
Fundación Miguel Lillo. Miguel Lillo 251, (4000) San Miguel de Tucumán, Argentina.
Autor corresponsal: paezvaleria@hotmail.com
Recibido: 13/10/15 – Aceptado: 30/11/15
Estudios meióticos en Agalinis fiebrigii y Agalinis
genistifolia (Orobanchaceae)
Resumen — Páez, Valeria de los A.; Aldo R. Andrada; Graciela E. Ruiz de Bigliardo.
2015. “Estudios meióticos en Agalinis fiebrigii y Agalinis genistifolia (Orobanchaceae)”. Lilloa
52 (2). Agalinis es un género americano y sus escasos antecedentes citogenéticos coinciden
en que las especies de Norteamérica presentan números básicos x = 13, 14 mientras que
las especies sudamericanas x = 16. En este trabajo se analiza la meiosis y se estima la
viabilidad del polen de A. fiebrigii y A. genistifolia, las únicas dos especies que se distribuyen
en el Noroeste Argentino. El número gametofítico observado en ambas especies de n = 16
es consistente con el número básico x = 16 presente en los taxones de Sudamérica. Duran-
te la meiosis se observaron irregularidades y cuerpos extranucleares, que son reportados por
primera vez en Agalinis.
Palabras clave: Agalinis, cuerpos extranucleares, meiosis, viabilidad del polen.
Abstract — Páez, Valeria de los A.; Aldo R. Andrada; Graciela E. Ruiz de Bigliardo.
2015. “Meiotic studies in Agalinis fiebrigii and Agalinis genistifolia (Orobanchaceae)”. Lilloa 52
(2). Agalinis is an American genus and their few cytogenetic backgrounds agree that North
American species exhibit basic chromosome numbers x = 13, 14 and the species of South
America x = 16. In this work, meiosis and the pollen viability are analyzed in A. fiebrigii and
A. genistifolia are estimated, the two unique taxa who grow in the Northwest of Argentina.
The gametophytic number n = 16 present in both species is consistent with the previous re-
port and agreed whit the basic number proposed for South American taxa. During meiosis
numerous irregularities are observed in ones specie and extra-nuclears bodies are reported
for the first time in Agalinis.
Keywords: Agalinis, extra-nuclear bodies, meiosis, pollen viability.
INTRODUCCIÓN
En la familia Orobanchaceae, el género
Agalinis Raf. es americano, compuesto por
plantas herbáceas, sufruticosas propias de
ambientes húmedos como secos y en un am-
plio rango altitudinal (Canne-Hilliker,
1988). El género ha sido sometido a una ex-
tensa revisión taxonómica avalada por estu-
dios moleculares que reubicaron al género
Agalinis en la familia Orobanchaceae, de su
ubicación anterior en Scrophulariaceae (de-
Pamphilis et al., 1997; Wolfe y dePamphilis,
1998; Yoder, 1999 y Stevens, 2001). Incluye
aproximadamente 70 especies y habita desde
el este de Estados Unidos, México, América
Central hasta Sudamérica (Neel y Cum-
mings, 2004). En América del Sur aunque se
encuentra en Brasil, Uruguay y Paraguay, la
mayoría de las especies ocupan la región
andina de Perú y Bolivia, mientras que en
Argentina y Chile, están muy poco represen-
tadas (Canne-Hilliker, 1988). En Argentina,
Castro Souza (2008) cita tres especies Agali-
nis fiebrigii (Diels) D’Arcy y A. genistifolia
(Cham. & Schltdl.) D’Arcy en el Noroeste
argentino (NOA), mientras que Agalinis com-
munis (Cham. & Schltdl.) D’Arcy se distribu-
ye más extensamente alcanzando el noreste,
centro, parte de Cuyo hasta el norte de la
Patagonia. Las especies del NOA son nativas,
así A. fiebrigii es un subarbusto que habita
desde los 2000 a 4500 msnm y A. genistifo-
lia también es un subarbusto pero hemipará-
sito, que se ubica entre 0 y 3000 msnm (Cas-
tro Souza, 2008).
Las especies sudamericanas de Agalinis,
han sido muy poco estudiadas, son escasos
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los antecedentes de la variabilidad morfoló-
gica, el comportamiento reproductivo, o los
estudios citológicos, puesto que la mayor
parte de la información proviene de las espe-
cies norteamericanas. Así, para las especies
norteamericanas de Agalinis y algunos géne-
ros afines, Canne (1981, 1984) estableció
dos números básicos x = 13 y x = 14. Sin
embargo, Canne-Hilliker (1988) sugirió en
las especies Sudamericanas uniformidad en
el número cromosómico gametofítico de n
= 16 de modo que disiente con los antece-
dentes de las especies de Norteamérica que
morfológicamente son menos diversas. Los
antecedentes de las especies sudamericanas
las señalan diploides con n = 16 y 2n = 32
cromosomas.
El objetivo del presente estudio es dar a
conocer los números cromosómicos, gameto-
fíticos, analizar el comportamiento del com-
plemento cromosómico durante la meiosis y
estimar por último, la viabilidad de los gra-
nos de polen de Agalinis fiebrigii y A. genis-
tifolia en poblaciones naturales de la provin-
cia de Tucumán (Argentina).
MATERIALES Y MÉTODOS
Las muestras se recolectaron en regiones
montañosas de la provincia de Tucumán, de-
positando el material de referencia en el her-
bario de la Fundación Miguel Lillo (LIL).
Agalinis fiebrigii. ARGENTINA. Prov. Tu-
cumán, Dpto. Tafí, El Rincón, 1850 m, 27/
XII/2007, Andrada-Páez (610750 A-B LIL)
(Fig. 1A).
Agalinis genistifolia. ARGENTINA. Prov.
Tucumán, Dpto. Burruyacú, Sierra de Medi-
na, 04/III/2009. Andrada-Páez (610032 LIL)
(Fig. 1B).
Los botones florales jóvenes se fijaron en
una solución de alcohol etílico – ácido acé-
tico en proporción 3:1 (Farmer); luego de 24
horas se transfirieron a alcohol 70º y se con-
servaron a -4ºC.
Se tomó como criterio para el análisis,
la observación de un mínimo de 50 células
por cada estadio meiótico y se emplearon
tres técnicas de coloración que se detallan a
continuación:
Tinción con orceína acética: el material
se sometió a hidrólisis ácida con HCl 1N a
Fig. 1 A) Agalinis fiebrigii. B) Agalinis genistifolia.
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60ºC durante 15 minutos, luego los restos
ácidos fueron eliminados con agua destilada.
La coloración y montaje de las preparaciones
microscópicas se realizaron con solución de
orceína acética al 45%.
Tinción con AgNO
3
: Las anteras fueron
tratadas durante 1 hora con una solución en-
zimática combinada (celulasa-pectinasa al
2%), cumplido el tiempo se lavaron en agua
destilada. La preparación microscópica se
obtuvo por aplastamiento con una gota de
ácido acético al 45%. Luego de 3 (tres) días
se procedió a la coloración con una mezcla
de AgNO
3
50% en solución acuosa combina-
da con dos gotas de solución reveladora co-
loidal (2g gelatina + 100 ml agua destilada
+ 1 ml acido fórmico) durante 20 minutos
(Howell y Black, 1980). Los restos de la tin-
ción argéntica se eliminaron por un lavado
en agua corriente durante 15 minutos. El
montaje de la preparación microscópica
para la observación se realizó con una gota
de agua glicerinada 10%.
Tinción con DAPI: el tratamiento previo
del material destinado a esta tinción fue
idéntico al de la tinción precedente. Después
de 3 (tres) días se procedió a la coloración
con DAPI propuesta por Schweizer (1976).
En la estimación de la viabilidad de los
granos de polen se empleó la solución de
Müntzig de glicerina-carmín acético al 1%
en la relación 1:1 (Sharma y Sharma, 1965).
Se consideraron viables aquellos granos de
polen que adquirieron coloración intensa.
Para esta estimación se contaron 1500 gra-
nos de polen por especie.
Las microfotografías se tomaron con una
cámara Moticam 1000 adosada a un mi-
croscopio óptico Nikon Eclipse E200. Las
microfotografías con fluorescencia se obtu-
vieron con una cámara Olympus Qcolor5 de
un microscopio Olympus BX43.
RESULTADOS
Los resultados de las observaciones se
presentan según las técnicas de coloración
empleadas en cada una de las especies estu-
diadas.
Agalinis fiebrigii
En las células madres de polen (CMP)
analizadas con la tinción convencional, se
identificó el número gametofítico n=16 (Fig.
2A). En profase y prometafase I se observa
un único nucléolo. La diacinesis regular con
16 bivalentes (16 II) es la más frecuente
(89%), mientras que el porcentaje restante
se distribuye entre las células con cromoso-
mas homólogos sin aparear o apareados for-
mando trivalentes en diferentes configura-
ciones (Fig. 2B-C). Aunque se observaron ca-
denas de cromosomas homólogos en prome-
tafase, su frecuencia fue despreciable. La
metafase I (MI) fue regular, sólo en el 7% de
ellas, un cromosoma se muestra fuera de la
placa medial (Fig. 2D). El comportamiento
de los cromosomas fue normal en anafase I
(AI) al igual que en la telofase I (TI). La
metafase II (MII), no mostró diferencias con
la MI (Fig. 2E), pero en anafase II (AII) se
registró sólo un 3% de cromosomas rezaga-
dos. La telofase II (TII) fue regular (Fig. 2F).
En el 45% de las células analizadas con
igual técnica de coloración, se ha observado
desde MI hasta TII uno o más cuerpos ex-
tranucleares de aspecto redondeado, simila-
res al nucléolo. Este tratamiento ha puesto en
evidencia una tinción diferencial de los mis-
mos. La débil tinción de los cuerpos se dife-
rencia claramente de los cromosomas homó-
logos con fuerte heteropicnosis positiva en
estas etapas (Figs. 2F). Asimismo como re-
sultado de la meiosis se evidenció la forma-
ción de tétradas, como así también móna-
das y héxadas (Fig. 2G).
En las células meióticas de Agalinis fie-
brigii cuando fueron sometidas a las técnicas
de impregnación argéntica, los cuerpos ex-
tranucleares adquirieron una coloración in-
tensa, positiva mientras que los cromosomas
mostraron un color claro, ligeramente ama-
rillo (Fig. 2H-I). La utilización del marcador
fluorescente DAPI no arrojó resultados posi-
tivos. Los cromosomas presentaron un aspec-
to homogéneo ante la excitación con la luz
ultravioleta, mientras que los cuerpos ex-
tranucleares se observaron de color gris,
opaco, claramente diferente al que presenta-
ron los cromosomas (Fig. 2J).
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Fig. 2. A-J) Agalinis fiebrigii: A) Diacinesis n = 16II. B-C) trivalente en diferentes configura-
ciones. D) MI con cromosoma fuera de placa. E) MII con cromosoma fuera de placa. F) TII
regular con cuerpos extranucleares (flechas). G) Tétrada y mónada. H-I) MI y TI respectiva-
mente con cuerpos extranucleares teñidos con AgNO
3
(flechas). J) TI con cuerpos extranu-
cleares con tinción DAPI (-) (flechas). K) Granos de polen viables con coloración intensa y
grano estéril no coloreado. 2A-J Escala = 6 µm, 2K Escala = 15 µm.
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La viabilidad de los granos de polen en
Agalinis fiebrigii alcanzó el 97%, los viables
se mostraron intensamente coloreados,
mientras que los inviables fueron de menor
tamaño y coloración tenue (Fig. 2K).
Agalinis genistifolia
El número gametofítico observado en
esta especie fue n = 16 (Fig. 3A). Un único
nucleolo se presenta en profase I y prometa-
fase I. La diacinesis mostró los 16 II. Asimis-
mo el 37.5% de las células en MI mostraron
segregación temprana de un par de cromoso-
mas (Fig. 3B) y en AI se detectó la formación
de puentes de cromatina y cromosomas reza-
gados (Fig. 3C). Fue algo mayor el porcenta-
je (40%) de células en MII que exhibieron
cromosomas fuera de la placa ecuatorial
(Fig. 3D). El 37.5 % de las células en TII
mostraron cromosomas rezagados. No se
observaron cuerpos extranucleares y la for-
mación de tétradas fue regular.
En esta especie al igual que en Agalinis
fiebrigii en las células tratadas con DAPI los
cromosomas se presentaron con tinción uni-
forme sin identificación de bandas.
En A. genistifolia la viabilidad de los
granos de polen estimada llegó al 98%, los
inviables, estériles, se tiñen débilmente y se
reconocen también por su menor tamaño
(Fig. 3E).
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La familia Orobanchaceae contiene
aproximadamente 2000 especies distribuidas
en 89 géneros donde la mayor parte de ellos
lo componen plantas heterótrofas. Agalinis es
un género americano con especies hemipará-
sitas que habitan principalmente en América
del Norte y por ello son las más estudiadas.
Las características morfológicas, anatómicas
y formas de vida entre otras, pone en eviden-
cia menor variabilidad en las especies norte-
americanas, que las poco investigadas de
América del Sur. Agalinis representa a un
grupo taxonómicamente difícil, sujeto a di-
versas revisiones por las que se sitúa al gé-
Fig. 3. A-E) Agalinis genistifolia: A) Diacinesis n = 16II. B) MI con cromosomas adelantados.
C) AI con cromosomas rezagados. D) MII con cromosomas fuera de placa. E) Grano de
polen coloreado viable y estéril sin tinción. 3A-D Escala = 6 µm. 3D Escala = 15 µm.
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nero en la familia que actualmente lo inclu-
ye y que asimismo brinda las evidencias de
la monofilia de la misma (Pamphilis et al.,
1997; Wolfe y dePamphilis, 1998; Yoder,
1999; Stevens, 2001). Los análisis de ADN
cloroplastídico establecieron claramente las
relaciones filogenéticas en el género y entre
géneros estrechamente relacionados (Bennett
y Mathews, 2006).
Aunque no se pone en duda la monofilia
de Agalinis como género, existe una clara
dicotomía de las características citológicas
de estas plantas. Los recuentos cromosómi-
cos efectuados para las especies de Nortea-
mérica revelan dos números básicos x = 13
y 14 (Canne, 1981, 1984; Canne-Hilliker,
1988). Los análisis de secuencias de ADN de
genes cloroplastídicos determinaron que un
único evento evolutivo ocasionó la reduc-
ción del número cromosómico n=14 a
n=13 (Neel y Cummings, 2004). Los pocos
estudios que generan los antecedentes de es-
pecies sudamericanas indican un número
básico diferente x = 16 para Agalinis de Ar-
gentina (citada para Buenos Aires), Uru-
guay, Perú y Bolivia (Hunziker et al.,1985;
Canne-Hilliker, 1988).
Nuestros resultados de los recuentos obte-
nidos de Agalinis fiebrigii y A. genistifolia
coinciden con los antecedentes bibliográficos
del género en Sudamérica. Asimismo indican
la naturaleza diploide de estas especies y la
marcada estabilidad de los números cromo-
sómicos x = n= 16 en contraste con las es-
pecies del hemisferio norte donde habrían
ocurrido procesos que condujeron a la poli-
ploidía y aneuploidía inter o intraespecífica.
La poliploidía se puso en evidencia en los
números cromosómicos gametofíticos de
Agalinis linifolia (Nutt.) Britton de n = 28
(Canne, 1984) y los recuentos 2n = 28 reali-
zados por Kondo et al. (1981). Asimismo, la
aneuploidía intraespecífica se pone de mani-
fiesto con los recuentos esporofíticos de A.
obtusifolia Raf. de 2n = 26 y 2n = 28, así
como los de A. purpurea (L.) Pennell de 2n =
28 y 2n = 30 (Kondo et al., 1981)
La estabilidad en el número cromosómi-
co en el género n = 16 demostrado por los
pocos antecedentes que se dispone de las es-
pecies de Agalinis, impide afirmar que este
sea el único número cromosómico haploide
ya que aun falta conocer los complementos
cromosómicos de otras especies de América
del Sur.
La interpretación de los cuerpos redon-
deados extranucleares con tinción diferencial
respecto al resto de cromosomas, que se pre-
sentan en el citoplasma cuando el núcleo y
la membrana nuclear pierden identidad du-
rante la división es poco clara. Folgerberg
(1938) los ha observado en especies del gé-
nero Cuscuta y Ross (1981) en Cactaceae,
quien intentó por intermedio del reactivo de
Schiff conocer químicamente su naturaleza.
Los resultados de esta reacción y la tinción
con DAPI en nuestras investigaciones dieron
negativa, indicando ausencia de ADN. Sin
embargo demuestra presencia de proteínas
posiblemente similares a las que se encuen-
tran asociadas al ADN ribosómico al ser po-
sitivo el tratamiento con impregnación ar-
géntica de Howell y Black (1980).
La falta de señales con DAPI indica au-
sencia de heterocromatina rica AT (adenina-
timina). Los números cromosómicos encon-
trados en Agalinis fiebrigii y A. genistifolia
estudiadas en la región montañosa de Tucu-
mán y el análisis del comportamiento meió-
tico representan las primeras investigaciones
del género en la región. La observación de
cromosomas rezagados o fuera de la placa
medial indica que podrían ser los responsa-
bles de la formación de mónadas y héxadas
al final de la división con posible desarrollo
de gametas genéticamente desbalanceadas.
Sin embargo la baja frecuencia de las ano-
malías consignadas en los resultados no
afectaría significativamente la viabilidad de
los granos de polen; viabilidad que alcanza
en A. fiebrigii y A. genistifolia el 97% y 98%
respectivamente.
Las dos especies estudiada Agalinis fiebri-
gii y A. genistifolia tienen el complemento
haploide n = 16 e irregularidades meióticas
en muy baja frecuencia que no afectan sig-
nificativamente la viabilidad del polen, lo
cual asegura en parte el éxito reproductivo
de estos taxones.
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