J. F. Castro, N. B. Muruaga: Efecto de plantas comerciales de uso medicinal...

Castro, Juan F.

; Nora B. Muruaga

Instituto de Fisiología Animal, Fundación Miguel Lillo. Miguel Lillo 251, (4000) San Miguel de Tucumán,

Argentina.

Herbario Fanerogámico, Fundación Miguel Lillo.

Autor corresponsal: felipecastrobiologo@gmail.com

Recibido: 25/03/15 – Aceptado: 26/06/15

Efecto de plantas comerciales de uso medicinal sobre

la actividad del complemento de suero de tortuga

(Chelonoidis chilensis: Testudinidae)

Resumen — Castro, Juan F.; Nora B. Muruaga. 2015. “Efecto de plantas comerciales

de uso medicinal sobre la actividad del complemento de suero de tortuga (Chelonoidis chilen-

sis: Testudinidae)”. Lilloa 52 (1). El objetivo de este trabajo consistió en determinar el efecto

in vitro de 27 plantas medicinales comercializadas en San Miguel de Tucumán sobre un

modelo experimental. Este modelo se basa en la actividad lítica espontánea que tiene la vía

alterna del sistema de complemento del suero de tortuga sobre eritrocitos de mamíferos. Se

utilizaron plantas medicinales de autenticidad comprobada en forma de infusión. Los resultados

mostraron que la mayor parte (15) de las plantas probadas, inhiben la hemólisis, algunas (2)

no tienen efecto y varias (10) lo aumentan. Los controles demostraron que la infusión de las

plantas no tuvieron efectos líticos per se sobre los eritrocitos. Los experimentos sugieren

que la acción de los componentes de las plantas se ejerce sobre la parte final de la cascada

lítica.

Palabras clave: Complemento; hemólisis; plantas; tortuga.

Abstract — Castro, Juan F.; Nora B. Muruaga. 2015. “Effect of commercial plants

for medicinal use on the activity of complement of turtle serum (Chelonoidis chilensis: Testu-

dinidae)”. Lilloa 52 (1). The aim of this work was determine the in vitro effect that, in an ex-

perimental model, have 27 medicinal plants commercialized in San Miguel de Tucumán. This

model is based on the spontaneous lysis activity that turtle blood serum alternative pathway

of complement system has over mammalian erythrocytes. Medicinal plants were used as

infusion. The results showed that most (15) of the tested plants inhibited hemolysis; some (2)

had no effect and several (10) increased it. The controls showed that the plants infusion had

no lytic effect on erythrocytes per se. Experiments suggest that the action of the vegetal

components is exerted on the last steps of the lytic cascade.

Keywords: Complement; hemolysis; plants; turtle.

INTRODUCCIÓN

Desde que existen registros históricos, y

seguramente desde antes, en muchos lugares

del mundo se usaron diferentes compuestos

activos presentes en las plantas para curar

enfermedades. El cono Sur de América no es

una excepción en este aspecto. Dichos com-

puestos activos, en la mayoría de los casos,

fueron posteriormente aislados y hoy juegan

un papel trascendental en la industria farma-

cológica, biomédica, y alimenticia (Alonso,

2007). La literatura sobre el tema en los as-

pectos históricos y culturales es amplia y va-

riada (Tsirkin, 1985; Makrides, 1998; Sadr

Lahijani et al., 2006; Ndhlala et al., 2009;

Molares y Ladio, 2009). El enfoque al que

queremos aproximarnos corresponde a las

relaciones entre las plantas medicinales y la

actividad del sistema del complemento.

Se conoce que los mecanismos de defensa

contra los organismos patógenos en los ver-

tebrados incluyen actividades citolíticas que

se encuentran en la sangre y secreciones de

estos animales y que está a cargo del men-

cionado sistema.

La activación del complemento puede

iniciarse por tres vías: la vía clásica, la vía

Lilloa 52 (1): 12–18, 2015

alternativa y la vía de las lectinas (Alsenz et

al., 1992). La vía clásica se activa por la

unión antígeno-anticuerpo, mientras que la

vía alternativa lo hace a partir de productos

bacterianos. La vía de las lectinas se activa

por estos compuestos y transcurre en forma

similar a la vía clásica (Regueiro y López

Larrea, 1998). Estas vías confluyen en un

punto donde el factor C5 se transforma en

C5b, lo que permite, en uno y otro caso, en-

trar en la fase terminal o lítica que conduce

a la lisis celular o bacteriana.

A partir de trabajos previos se sabe que en

el suero sanguíneo de peces (Suner y Tort,

1994), de anuros (Fernández, 1986), de ofi-

dios (Fernández y Saad de Schoos, 1990) y

de tortugas (Castro y Fernández, 2009), se

encuentra actividad del sistema de comple-

mento capaz de lisar eritrocitos de mamífe-

ros a través de la vía alterna, la cual no ne-

cesita de la presencia de anticuerpos para

su actividad.

Por otra parte y estrechamente vinculado

con los ensayos sobre los mecanismos de ac-

ción de las plantas medicinales, se encuen-

tra el tema de la identificación de las espe-

cies vegetales a utilizar. Este es un aspecto

que necesita mucha precisión, dada la im-

portancia que tiene para la salud el grado

de autenticidad de las plantas medicinales

que se comercializan en herboristerías como

productos no sujetos a control. Éstas se ex-

penden como, por ejemplo, mezclas de ho-

jas, trozos de tallos, cortezas de tallos, flo-

res, inflorescencias y frutos, y están rotula-

das, en general, con su nombre vulgar; en

muy pocos casos contienen el nombre cientí-

fico. La identificación de las plantas consti-

tuyó la parte inicial del presente estudio, ya

que algunas plantas tienen semejanza tanto

en su denominación vulgar como en sus ca-

racteres morfológicos, por lo que dan lugar

a la adulteración o sustitución de especies.

El objetivo de este trabajo es poner a prue-

ba el efecto de componentes de plantas utili-

zadas corrientemente en medicina popular

sobre la actividad del sistema de complemen-

to (en su vía de activación alternativa sobre

eritrocitos humanos) del quelonio Chelonoi-

dis chilensis Gray (Testudinidae–Testudines).

En este sentido, la utilización de un mo-

delo experimental que incluya un mecanis-

mo espontáneo de lisis sobre eritrocitos he-

terólogos constituye una ventaja práctica y

de gran simplicidad para probar el efecto in

vitro de las plantas medicinales sobre un

mecanismo, como el del complemento, que

es bastante complejo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras de suero de tortuga.— Se usa-

ron tortugas pertenecientes a la Reserva Ex-

perimental de Horco Molle de la Universidad

Nacional de Tucumán. La sangre se extrajo

de la vena yugular por punción en indivi-

duos previamente anestesiados con Ketamina

[2-(2- clorofenil)-2-(metilamino) cicloexano-

na], (20 mg por kilo de animal). La sangre

se colectó sin anticoagulantes. Se separó el

coágulo por centrifugación y el suero se con-

servó a -18 ºC hasta su utilización.

Glóbulos rojos humanos.— Se extrajo

sangre humana con heparina SOBRIUS

(5000 UI/ ml) como anticoagulante en una

concentración de 1/10. Se centrifugó 10 mi-

nutos a baja velocidad y se tomaron los gló-

bulos rojos, con los cuales, luego de lavarlos

3 veces con buffer fosfato salino (PBS), se

realizó una suspensión al 5 % en buffer

Complemento.

Buffers utilizados.— PBS (buffer fosfato

salino): NaCl 6,8 g/l, NaHPO

1,4 g/l,

0,43 g/l. Buffer Complemento: NaCl

140 mM, Tris (tris-hidroximetilaminometa-

no) 10 mM, CaCl

0,1 mM, MgCl

0,1 mM.

Buffer EDTA: NaCl 140 mM, Tris 10 mM,

EDTA (etilendiamino-tetraacético) 5 mM.

Plantas medicinales.— Identificación: Se

seleccionaron para este trabajo 27 muestras

por ser las más utilizadas popularmente por

sus efectos antiinflamatorios. Estas muestras

fueron adquiridas en un comercio dedicado

a la venta de plantas usadas corrientemente

en la medicina popular en San Miguel de

Tucumán (Cuadro 1). Para comprobar la

autenticidad de las plantas medicinales se

J. F. Castro, N. B. Muruaga: Efecto de plantas comerciales de uso medicinal...

estudiaron bajo microscopio estereoscópico

las distintas partes del contenido de las

muestras y se reconocieron características

morfológicas (vegetativas y reproductivas)

que permitieron identificar taxones tanto a

nivel de género como de especie, debido a

que las plantas contaron con órganos repro-

ductivos y vegetativos como los ejemplares

de herbario. Se utilizó para los aspectos

taxonómicos la siguiente bibliografía: Bar-

boza et al. (2001); Bravo et al. (1983), Ca-

brera (1971); Digilio y Legname (1966);

Keisling y Ferrari (2005); Ragonese y Covas

(1945); Tolaba y Fabbroni (1998).

Cuadro 1. Listado de muestras comerciales de plantas utilizadas como antiinflamatorio en

medicina popular. Mezcla (a): trozos de tallo, hoja y fruto (sin flor). Mezcla (b): trozos de cor-

teza, trozos de tallo, hoja, fruto y flor o inflorescencia. (c): trozos de rama, hoja, fruto y flor.

Lilloa 52 (1): 12–18, 2015

Preparación de las infusiones.— Se hicie-

ron infusiones usando 2 g de cada hierba en

20 ml de agua corriente. Se llevó el agua

hasta ebullición, se retiró de la fuente de

calor y se le agregó la hierba previamente

pesada. Se dejó reposar por 30 min y se se-

paró la infusión usando papel de filtro. La

muestra de la infusión así obtenida se utilizó

en el día o se guardó a -10 ºC hasta su utili-

zación. Con todas las plantas analizadas se

procedió de la misma manera y en ensayos

por triplicado (Prabhakar et al., 2006; Liza-

rraga et al., 2012).

Actividad hemolítica del suero de tortu-

ga.— En cada tubo se puso: 500 µl de suero

de tortuga al 10 % diluido en buffer comple-

mento, más 200 µl de la infusión determina-

da, y se llevó a 30 ºC por 30 minutos a baño

maría. A continuación se le agregó 100 µl de

la suspensión de eritrocitos humanos al 5 %

y se llevó a 30 ºC por 45 minutos. Posterior-

mente se le agregó 1,2 ml de buffer Comple-

mento-EDTA, se centrifugó 10 minutos a

1500 rpm en una centrífuga ROLCO de

mesa; se tomó el sobrenadante y se leyó a

450 nm en un espectrofotómetro Zeltec ZL-

5100. Para determinar la hemólisis espontá-

nea, en tubos paralelos se pusieron 700 µl de

buffer Complemento y se llevó a 30 ºC por

30 minutos a baño María, se le agregó 100

µl de glóbulos rojos al 5 % y se incubó du-

rante 45 minutos a 30 ºC; luego de agregar

1,2 ml de buffer Complemento-EDTA frío se

centrifugó y se leyó a 450 nm. En un tercer

grupo de tubos se midió la hemólisis total

para la cual se pusieron 700 µl de tritón X-

100 1/1000 y 100 µl de eritrocitos al 5 %;

después de centrifugar y luego de agregarle

1,8 ml de buffer Complemento-EDTA el so-

brenadante se leyó a 450 nm. Un cuarto gru-

po de ensayos correspondió al control, con-

sistente en comprobar si las infusiones solas

(sin suero de tortuga) tenían actividad he-

molítica.

El efecto inhibidor, determinado como

porcentaje de la hemólisis original produci-

da por el Complemento (medida como au-

mento de D.O. a 450 nm), es el cambio pro-

ducido por dos volumen de infusión más cin-

co volúmenes de suero de tortuga al 10 %,

sobre un volumen de una suspensión de eri-

trocitos de mamíferos al 5 % en buffer Com-

plemento. Para ser usado en este trabajo he-

mos designado como 1 (una) unidad de inhi-

bición a una disminución de un 1 % en los

valores de la hemólisis sin agregados.

Análisis estadístico:

El análisis de los resultados se llevó a

cabo usando el programa Excell indicando

coeficiente de variación.

RESULTADOS

Se seleccionaron 27 muestras por ser las

más utilizadas popularmente en medicina

por sus efectos antiinflamatorios.

Los resultados de la hemólisis con suero

tratado con plantas fueron comparados con

la hemólisis sin tratamiento. Se analizaron

infusiones a partir de estas 27 muestras

(Cuadro 1).

Dos infusiones de plantas medicinales

inhibieron la actividad complementaria en

más del 75 %: Lepidium didymum y Rumex

pulcher; tres lo inhibieron entre un 75 % y

un 50 %: Acryrocline satureioides, Marru-

bium vulgare y Senecio sp. Por otro lado Atri-

plex sp., Geoffroea decorticans, Acorus sp.,

Ambrosia elatior y Minthostachys mollis,

mostraron una actividad inhibitoria entre el

50 y el 25 %. En el caso de Schinopsis loren-

tzii, Larrea divaricata, Passiflora sp., Bauhi-

nia forficata y Plantago lanceolata, mostra-

ron un efecto inhibitorio menor al 25 %,

pero siempre claramente diferente del testi-

go, la actividad natural del complemento.

Schinus fasciculatus y Parietaria debilis no

presentaron diferencia con respecto a la he-

mólisis sin tratamiento, es decir que los va-

lores hemolíticos de estos ensayos fueron

muy cercanos al 100 % original (Fig. 1). En

10 muestras se observó una actividad mayor

al 100 %; es decir que no inhibieron, sino

por el contrario, aumentaron el efecto hemo-

lítico del suero sanguíneo de tortuga. Estas

son: Hamamelis virginiana, Erythrina sp.,

Ginkgo biloba, Lavandula sp., Matricaria

J. F. Castro, N. B. Muruaga: Efecto de plantas comerciales de uso medicinal...

chamomilla, Tunilla sp., Lupinus sp., Limo-

nium brasiliense, Lippia turbinata, Aristolo-

chia elegans (datos no mostrados).

Los controles de un posible efecto hemo-

lítico propio demostraron que las infusiones

de las plantas (sin suero de tortuga) no tu-

vieron efectos líticos sobre los eritrocitos.

DISCUSIÓN

La determinación taxonómica de las

plantas medicinales, adquiridas en comer-

cios de San Miguel de Tucumán, permitió

evidenciar que, en muchos casos, las mues-

tras contenían material insuficiente para su

Fig. 1. Efecto inhibitorio de plantas medicinales sobre la actividad del complemento del suero

sanguíneo de tortuga. Porcentaje de inhibición respecto a la lisis natural. En ninguna de las

muestras la dispersión de los datos supera el 9,1 % de coeficiente de variación.

Lilloa 52 (1): 12–18, 2015

determinación taxonómica, por lo que en

algunos casos sólo se pudo llegar a identifi-

car a nivel de género. Solamente aquellas

(27) por ser las más utilizadas popularmente

por sus efectos antiinflamatorios, fueron uti-

lizadas para este trabajo. Ello fue decidido

debido a que los resultados de otras mues-

tras que contenían más de una especie (pro-

ductos botánicos no puros) no tendrían utili-

dad práctica, de acuerdo con el objetivo de

este estudio, y su significado científico que-

daría supeditado a análisis futuros.

En un trabajo reciente hemos descripto el

efecto que el suero sanguíneo de tortuga tie-

ne sobre eritrocitos de mamíferos (Castro y

Fernández, 2009). Este efecto lítico corres-

ponde a la activación del sistema de comple-

mento del quelonio que es independiente de

la presencia de anticuerpos y correspondería

a la vía alternativa. Cómo modelo experi-

mental el método es simple, rápido y de

bajo costo. El hecho destacado en el presente

trabajo es que numerosas plantas medicina-

les tienen efecto sobre este mecanismo lítico.

Además de las plantas que no lo afectan,

hemos observado que la mayoría (15) inhibe

al sistema lítico, mientras que otras (10)

aumentan la actividad lítica. Los resultados

de los controles que se hicieron utilizando la

infusión de las plantas, sin el agregado de

suero de tortuga, demostraron que las infu-

siones no tienen actividad lítica.

Como consecuencia de lo anterior, se con-

firma que la actividad lítica del suero del

reptil sobre los eritrocitos ensayados no se

está ejerciendo en toda su capacidad en nues-

tro modelo. Esta actividad moderada es una

ventaja para nuestros ensayos pues de otra

manera no habríamos podido observar esta

característica amplificadora del grupo de

plantas. Si bien nuestros ensayos demuestran

que el modelo experimental empleado utili-

zaría la vía alterna, los experimentos con

las plantas podrían estar poniendo en evi-

dencia una acción de los componentes vege-

tales que se ejercerían sobre la parte final, y

común a las tres vías de activación del siste-

ma de complemento. Creemos que las inves-

tigaciones en este campo pueden aclarar el

efecto antiinflamatorio que se destaca en el

uso popular de estas plantas y que presenta-

rían un efecto regulador sobre el sistema de

complemento. A partir de este trabajo se

propone comenzar con la búsqueda del com-

ponente o de los componentes responsables

de tal actividad.

La relación entre las plantas medicinales

de uso popular de la Argentina y patologías

concretas está siendo exitosamente explora-

da en los últimos tiempos (Grau et al.,

2001; Aybar et al., 2001; Genta et al., 2009;

McClatchey et al., 2009; Pawlaczyk et al.,

2009; Zampini et al., 2009; Lima et al.,

2011; Scarpa, 2004; Barboza et al., 2009),

lo que prueba el interés y la importancia del

conocimiento de los mecanismos a través de

los cuales actúan las plantas medicinales.

Debemos mencionar que los resultados

encontrados en nuestros ensayos vinculados

a la actividad inhibitoria son coincidentes

con las indicaciones usuales sobre la utiliza-

ción de estas plantas en la medicina tradi-

cional, que atribuyen a algunas de ellas

efectos antiinflamatorios; lo cual abre un

panorama promisorio para mayores estudios

al respecto.

AGRADECIMIENTOS

A José Yapur por su colaboración en la

adquisición de las muestras de suero de tor-

tuga. A la Mag. Pilar Medina Pereyra y a la

Bqca. María Eugenia Pérez por la lectura

objetiva y sugerencias. Este trabajo se llevó a

cabo con el apoyo de la Fundación Miguel

Lillo.

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