Acta zoológica lilloana 51 (2): 127–136, 2007 127 Análisis citogenético, genitales externos y distribución de Ligocatinus spinatus (Orthoptera: Tettigoniidae: Phaneropterinae) Ruiz de Bigliardo, Graciela E. 1-2 ; María S. Caro 2 ; Mabel Romero Sueldo 1 y Ana María Frías de Fernández 1 1 2 Instituto de Genética. Fundación Miguel Lillo. Miguel Lillo 251, (4000) San M. de Tucumán. Argentina. Facultad de Ciencias Naturales. U.N.T. Miguel Lillo 205, (4000) San M. de Tucumán. Argentina. Esta dirección de correo electrónico está protegida contra los robots de spam, necesita tener Javascript activado para poder verla R E S U M E N — En este trabajo se realizó el estudio citogenético en ejemplares machos de Ligocatinus spinatus (Brunner) (Tettigoniidae, Phaneropterinae), se describió la morfología externa de los genitales de ambos sexos y se amplió su distribución geográfica. Los ejemplares estudiados fueron colectados en áreas de pastizales del Dpto. Burruyacú (Tucumán). Para el análisis del cariotipo, de la meiosis y de los genitales se emplearon las técnicas convencionales. En L. spinatus, el número cromosómico diploide en el Ÿ es 2n = 31. El análisis de la meiosis puso en evidencia diferencias intrafoliculares. La presencia de un cromosoma B de gran tamaño probablemente sea responsable del comportamiento de algunas células. Asimismo, se describieron y esquematizaron los genitales externos del macho (phallus) y la espermateca de la hembra. En cuanto a la d i s t r i b u c i ó n g e o g r á f i c a s e c i t ó p o r p r i m e r a v e z l a p r e s e n c i a d e L . s p i n a t u s para la provincia de Tucumán. PALABRAS CLAVE: Citogenética, cromosomas, meiosis, genitales, distribución geográfica, Orthoptera, Ligocatinus spinatus. A B S T R A C T — A cytogenetic study on Ligocatinus spinatus (Brunner) (Tettigoniidae, Phaneropterinae) is presented. The external morphology of the genitals of both sexes is described and its geographic distribution is extended. Specimens were collected in grassy areas of the Burruyacú Depar tment (Tucumán). Conventional techniques were used for karyotype analysis, meiosis and genitals. In L. spinatus, the chromosomal count in Ÿ is 2n = 31. The meiosis analysis showed evidence of intrafollicular differences. The presence of a B chromosome of great size may be the reason for the behaviour of some cells. In addition, the external genitals of the male (phallus) and the spermatheca of the female are described and illustrated. As for the geographic distribution, the presence of L. spinatus is cited for the first time for the province of Tucumán. KEYWORDS: Cytogenetic, chromosomes, meiosis, genitals, geographic distribution, Orthoptera, Ligocatinus spinatus. INTRODUCCIÓN Los Tettigoniidae, entre los Ortópteros representan al grupo menos estudiado desde el punto de vista citogenético. Esta familia se diferencia de los Acrididae por presentar una amplia variación en la morfología y en el número cromosómico entre especies estrechamente relacionadas. El número cromosóRecibido: 12/11/07 – Aceptado: 17/10/08 mico diploide varía entre 2n = 13 y 2n = 39 (Ferreira, 1977; Aswathanarayana y Ashwath, 1985, 1995). Entre los Phaneropterinae, 86 especies han sido estudiadas citogenéticamente. La mayoría de los trabajos publicados consisten en descripciones del número cromosómico, morfología, mecanismo de determinación del sexo y comportamiento durante la meiosis (Piza, 1977; Ferreira et 128 G. E. Ruiz de Bigliardo et al.: Análisis citogenético de Ligocatinus spinatus al., 1976; Warchalowska-Sliwa, 1998; Warchalowska-Sliwa y Heller, 1998; Ruiz de Bigliardo et al., 2006; Ferreira y Mesa, 2007) Los antecedentes mostraron en la subfamilia números cromosómicos extremos de macho 2n = 16 y macho 2n = 33. La mayoría de sus especies son macho 2n = 31 (con todos los cromosomas acrocéntricos) o un número derivado originado principalmente por fusiones en tandem, cambios robertsonianos o inversiones pericéntricas. La mayoría de las especies tienen un sistema de determinación del sexo X0/XX y sólo seis especies son neoXY–neoXX y una X1X 2Y– X1X1X2X2 (Ferreira y Mesa, 2007). Los estudios taxonómicos sobre L. spinatus Brunner, aportan claves, caracteres morfológicos (no incluyen genitalia) y datos sobre su distribución, (Brunner von Wattenwyl, 1878, 1891; Rehn, 1913; Bruner, 1915; Pirán, 1941), el trabajo más reciente corresponde a Romero Sueldo (2006) sobre el espermatóforo de esta especie. El conocimiento de la estructura de los genitales externos aportaría información básica para la taxonomía del grupo. En la actualidad, estos aspectos han sido poco estudiados. Hacia fines de la década del 60, Márquez Mayaudon (1969) realizó estudios sobre los genitales y cromosomas de los faneropterinos de México, y no incluyó a L. spinatus por estar ausente en la entomofauna de ese país. Con posterioridad Romero Sueldo (1993, 1998) describe la genitalia de otras especies de la subfamilia Phaneropterinae (Stilpnochlora incisa Brunner, S. marginella (Serville) y Burgilis curta Serv). Ligocatinus spinatus es una especie típica de América del Sur, citada en Perú y Bolivia por Bruner (1915), en Brasil (Ferreira 1969, 1976, 1977; Ferreira et al. 1976) y en Argentina en las provincias de Buenos Aires (Giglio Tos, 1894; Brunner von Wattenwyl, 1891) y Jujuy (Giglio Tos, 1894; Rehn, 1913). El objetivo de este trabajo fue analizar la meiosis y caracterizar citogenéticamente a L. spinatus. Además se aportaron caracteres morfológicos de la genitalia de la hembra y del macho, como así también se amplió su distribución geográfica, para la cual no había antecedentes. MATERIALES Y MÉTODOS Los ejemplares empleados en estudios de laboratorio fueron colectados con red entomológica de arrastre en áreas de pastizales, correspondientes a la localidad de Macomita (Dpto. Burruyacú, 26º44’ S, 64º08’ W) de la Provincia de Tucumán (Figs. 1 y 2). Los relevamientos se realizaron durante los meses de septiembre a marzo de 2005 y 2006. Para los estudios citogenéticos, se utilizaron ejemplares Ÿ adultos de L. spinatus. El estudio de la meiosis se realizó en testículos, a los que se los sometió a un choque hipotónico con ClK 75 mM durante 30’ y se los fijó en metanol-ácido acético glacial (3:1). La coloración con Feulgen para ADN se realizó después de una hidrólisis ácida débil con HCl 1 N por 20’ a 65ºC. El medio de montaje utilizado para las preparaciones transitorias fue ácido acético 45% y luego para las definitivas, se empleó un medio de montaje neutro. La morfología de los cromosomas se describió usando la nomenclatura de Levan et al. (1964). Para la observación de las genitalias se siguió la metodología clásica: se reblandeció la parte posterior del abdomen en KOH 10% en caliente y luego el material se lavó con agua destilada y conservó en alcohol 70%. Los caracteres utilizados para la descripción de la genitalia son: la forma y tamaño de los lóbulos del phallus, principalmente del ventral y la armadura de la cavidad dorsal. En la hembra se consideró la forma de la vesícula espermatecal, la longitud del conducto y la presencia o ausencia de esclerosis en el asa. La terminología empleada corresponde a la citada en Márquez Mayaudon (1969). RESULTADOS El análisis citogenético de las células de los folículos testiculares de Ligocatinus spinatus revela un complemento cromosómico diploide 2n = 31 (macho) y un sistema cromosómico del sexo XO:XX (macho/hembra). Acta zoológica lilloana 51 (2): 127–136, 2007 129 Fig. 1 (arriba). Macho de Ligocatinus spinatus. Fig. 2 (abajo): Hembra de Ligocatinus spinatus. 130 G. E. Ruiz de Bigliardo et al.: Análisis citogenético de Ligocatinus spinatus Los cromosomas autosómicos y el cromosoma sexual X son telocéntricos y este último de mayor tamaño que los autosomas. Los cromosomas autosómicos se agrupan de acuerdo a su tamaño en 6 pares de cromosomas grandes, 6 pares medianos y 3 pequeños (Fig. 3). Al analizar las células en meiosis se evidencia un mosaico intrafolicular. En algunas de ellas se observa un comportamiento normal tanto de los autosomas como del cromosoma sexual X. El cromosoma sexual es fuertemente heteropicnótico en las primeras etapas de la profase meiótica y se ubica por fuera del resto de los cromosomas autosómicos en metafase I (Fig. 4). Además del cromosoma sexual heteropicnótico, se identifica a un cromosoma accesorio o B de mayor tamaño en otras células durante la profase meiótica, pero con una heteropicnosis menor a la que se observa en el cromosoma sexual (Fig. 5). La presencia del cromosoma B en estas células se asocia a la observación de irregularidades durante el desarrollo de la meiosis. El cromosoma extra y el cromosoma sexual X se identifican por una fuerte heteropicnosis positiva en diplotene de la línea germinal (Fig. 6). La heteropicnosis negativa de los cromosomas autosómicos en las primeras etapas de la profase se revierte a medida que ella transcurre, hasta alcanzar los cromosomas autosómicos, sexual y B, la heteropicnosis positiva en diacinesis En la anafase I se observa al cromosoma accesorio o B rezagado, a manera de un puente uniendo ambos grupos cromosómicos (Fig. 7). Ade- más en algunas células se observa la ruptura del puente (Fig. 8). Durante la meiosis II se evidencia una asincronía en el comportamiento de las células: las que no llevan el cromosoma B están en una etapa más avanzada que aquellas que lo presentan. Al finalizar la primera división meiótica, ciertas células llevan el cromosoma sexual X y otras el cromosoma B. (Fig. 9). Ambos cromosomas se distinguen del resto por ubicarse fuera del polo telofásico I y por su tamaño. Asimismo se observa la fusión del contenido nuclear de células telofásicas II, con la subsiguiente formación de macro y microespermátidas (Fig.10 y 11). Los genitales externos de L. spinatus están ocultos en ambos sexos y comprenden el phallus en el macho y la espermateca en la hembra. El phallus tiene una longitud total de 2,42 mm y 1,48 mm de ancho máximo (Fig. 12 a y b). Los lóbulos laterales (ll) están bien desarrollados y cubren casi por completo los lóbulos dorsales (ld) que son de aspecto carnoso y llevan pliegues mediales (Fig. 12a). El lóbulo ventral (lv) es corto y presenta una invaginación media apical bien marcada. La cavidad dorsal (cv) es ancha y profunda con procesos internos esclerotizados. Las vesículas seminales (vs) son esféricas, con un ancho máximo de 0,68 mm y un largo de 0,9 mm, con paredes lisas y conductos cortos (Fig.12b). En la hembra la espermateca tiene una vesícula redondeada (v) y un conducto (cc) que es dos veces más largo que la vesícula, con un asa esclerosada en posición basal (Fig. 13). La base del Fig. 3. Idiograma del complemento cromosómico haploide de un macho de Ligocatinus spinatus: n = 15 + X + B. Acta zoológica lilloana 51 (2): 127–136, 2007 131 las gramíneas, podemos citar Panicum maximum Jacquin (“pasto Guinea”), Paspalum commune Lillo, Paspalum urvillei Steudel (“paja boba” o “paja mansa”), Paspalum notatum Flügger var. latiflorum Doell., Bromus catharticus Vahl (“cebadilla criolla”), Sorghum halepense (L) Persoon (“sorgo de Alepo” o “ pasto ruso”), Digitaria insularis (L) Mez (“pasto amargo” o “pasto cabezón”), Setaria geniculata (Lam) Beauv (“cola de zorro”) y Eleusinae indica (L) Gaertn. En cultivos de soja y limón se detectó la presencia de L. spinatus, representada por poblaciones poco densas y posiblemente no establecidas en los mismos. ovopositor está recubierta por la placa subgenital, formando una cámara donde desemboca el oviducto y el conducto espermatecal. En cuanto a la distribución de L. spinatus fue citada en las provincias de Buenos Aires (Giglio Tos, 1894; Brunner von Wattenwyl, 1891) y Jujuy (Giglio Tos, 1894; Rehn, 1913) de la Argentina. En este trabajo se amplía su distribución a la provincia de Tucumán. La especie vive preferentemente en comunidades vegetales silvestres y ocasionalmente se la encuentra en cultivos. La mayoría de los ejemplares se colectaron en áreas de pastizales, donde predominan las gramíneas (Poaceae) y Ciperáceas. Dentro de Fig. 4. Metafase I. La flecha muestra el cromosoma sexual X. Fig. 5. Metafase I. Las flechas indican el cromosoma sexual X y el cromosoma accesorio B. Fig. 6. Diplotene donde se pone en evidencia la fuerte heteropicnosis positiva del cromosoma sexual X y el cromosoma B. Fig. 7. Anafase I. El cromosoma B une ambas masas cromosómicas. Las barras representan 10 µ. 132 G. E. Ruiz de Bigliardo et al.: Análisis citogenético de Ligocatinus spinatus DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Los aspectos comparativos habían demostrado que la variabilidad en el número cromosómico y en la morfología es mayor en Phaneropterinae que en las restantes subfamilias, variando el número cromosómico diploide entre 16 y 33 (macho) (Pearson, 1929; Dave, 1965; Ferreira, 1969; CisnerosBarrios et al., 1990; Ferreira y Mesa, 2007). Asimismo el cariotipo 2n = 31 se había observado en 48 de las 86 especies estudiadas y la mitad de ellas presentaron únicamente cromosomas acrocéntricos con un NF = 31. La especie estudiada en el presente trabajo L. spinatus, posee un número cromosómico diploide 2n = 31 (macho), con todos sus cromosomas telocéntricos. Nuestros resultados son concordantes con el cariotipo básico para la subfamilia 2n = 31 (macho) y el que se considera ancestral para la mayoría de los Phaneropterinae (Ferreira y Mesa, 2007). Este cariotipo básico es predominante en otras 11 subfamilias de Tettigoniidae analizadas por otros investigadores (Warchalowska-Sliwa, 1998). No obstante la escasez de información citológica es posible evaluar los principales mecanismos que explican la evolución de los cariotipos en esta subfamilia. En aquellas especies con reducción en el número cromosómico, se atribuye el origen a fusiones en tandem, lo que incrementaría la longitud de algunos cromosomas (Ferreira, 1969; Mesa y Ferreira, 1977; Cisneros–Barrios et al., 1990; Ferreira y Mesa, 2007) Las fusiones céntricas no son relevantes entre los Phaneropterinae, como tampoco las inversiones pericéntricas. Sólo se han detectado inversiones pericéntricas en el cromosoma sexual X (Beaudry 1973; Muthu, 1987, 1988) modificando la posición del centrómero, pero no hay información de inversiones Fig. 8. Telofase I. El puente establecido por el cromosoma B en algunas células se rompe, lo que está indicado por la flecha. Fig. 9. Anafase I. Una de las células hijas es portadora del cromosoma sexual X y la otra el cromosoma accesorio B. Fig. 10. Fusión nuclear. En una de las células sólo se observa una mínima fracción de cromatina con la posible consecuencia de la formación de un micronúcleo indicado con la flecha (m). Fig. 11. Espermátidas. Se ponen en evidencia espermátidas normales (N), micro (m) y macroespermátidas (M). Las barras representan 10 µ. Acta zoológica lilloana 51 (2): 127–136, 2007 133 pericéntricas que involucre a los cromosomas autosómicos. Los estudios citogenéticos en L. spinatus, revelaron una clara diferencia en la meiosis de aquellas células portadoras y no portadoras del cromosoma accesorio B. Las irregularidades en el comportamiento de los cromosomas durante la división meiótica se manifiestan por la presencia de puentes en anafase I y formación de macro y microespermátidas (Fig. 7 y 8) En langostas se describieron numerosos casos de inestabilidad mitótica antes de la formación de los folículos testiculares o durante la mitosis espermatogoniales, por lo que se pueden encontrar células con distintos números de cromosomas B (White, 1973). La mayoría de los cromosomas B son heterocromáticos, fomentando la idea que estos elementos son genéticamente inertes (Camacho et al., 2000). Sin embargo, algunos cromosomas B muestran actividad transcripcional y muchos otros cromosomas B portan los genes ribosomales (Green, 1988, 1990; Brockhouse et al., 1989; Jones, 1995; Beukeboom, 1994). Existe abundante evidencia que los cromosomas B pueden afectar una multitud de procesos celulares y fisiológicos en plantas y animales. Los efectos se manifiestan raramente en el fenotipo externo. Los cromosomas B muy frecuentemente afectan procesos o caracteres asociados con el desarrollo, el vigor, la fertilidad y la fecundidad (Camacho et al., 2000; Jones, 1995; Jones y Rees, 1982). Estas influencias negativas en la aptitud del hospedador señalan la naturaleza parasítica de los cromosomas B (Hewitt, 1979; Bidau, 1987; Bidau y Canfolonieri, 1988). En los ortópteros el efecto de los Bs en la espermiogénesis lleva a incrementar la producción de macro y microespermátidas (Nur, 1969; Bidau, 1986, 1988; Suja et al., 1986; Bidau y Canfolonieri, 1988). En Orthoptera, el nivel basal de espermátidas anormales es usualmente muy bajo (Suja et al., 1986). La observación de macroespermátidas se correlaciona con un posible bloqueo de la citocinesis por la presencia del univalente B. Otra de las consecuencias es la separación citoplasmática desigual o fusión Fig. 12. Phallus de Ligocatinus spinatus : a) vista dorsal b) vista ventral. Fig. 13. Espermateca de la hembra de L. spinatus. 134 G. E. Ruiz de Bigliardo et al.: Análisis citogenético de Ligocatinus spinatus nuclear; ambas circunstancias afectarían el proceso celular responsable de la formación de espermátidas normales (Hewitt, 1973). La incapacidad de una citocinesis normal puede explicarse también por la presencia de cromosomas autosómicos o cromosomas B rezagados. Por otra parte se demostró en Metaleptea adspersa (Acridinae, Acrididae) que los cromosomas B de gran tamaño no bloquean la citocinesis, pero inducen la división desigual y fusión nuclear (Bidau, 1986). Sin embargo, también está demostrado que los cromosomas B no siempre conducen a meiosis irregulares, aunque haya formación de macroespermátidas. En este caso los cromosomas B afectan el mecanismo de mantenimiento de los puentes citoplasmáticos, llevando a la formación de fusiones nucleares (Suja et al., 1986, 1987). Por otra parte, si la presencia de los cromosomas B conduce a separaciones citoplasmáticas desiguales, ejercen su efecto sobre la migración de los cromosomas hacia los polos durante anafase I. Por lo tanto, la alteración de estos mecanismos podrían ser también causas de formación de microespermátidas. Las anomalías solamente han sido observadas en aquellas células de los folículos donde se ha observado al cromosoma B. Las células no portadoras de B mostraron un comportamiento meiótico normal. El estado actual del conocimiento de la genitalia no permitió efectuar comparaciones con las otras especies del género. Se debe destacar que este trabajo representa el primer aporte citogenético y caracteres morfológicos de los genitales externos de la especie. Además es importante destacar que es la primera vez que se cita en Tucumán, en amplias áreas de pastizales; quedando esta provincia incluida en el radio de distribución. AGRADECIMIENTOS Turk por la lectura crítica de los aspectos morfológicos presentados en este trabajo. BIBLIOGRAFÍA Aswathanarayana, N. V. & S. K. Ashwath. 1985. Kar yology of Tettigonids (Class: Insecta): Chromosomes and constitutive heterochromatin in Euhexacentrus annulicornis Stol. (Subfam: Listroscelinae). Entomon. 10 (2): 97-101. Aswathanarayana, N. V. & S. K. Ashwath. 1995. Kar yotypes of Two Indian Grasshoppers of Mecopodinae (Orthoptera, Tettigoniidae). Cytologia 59 (3): 285287. Beaudry, J. R. 1973. Une analyse des complements chromosomiques de certains orthopteres du Quebec et sa signification taxonomique et evolutionnaaire. Can. J. Gen. Cytol. 15: 155-170. Beukeboom, L. W. 1994. Bewildering Bs: an impression of the lst B-chromosome conference. Heredity 73: 328-336. Bidau, C. J. 1986. 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