12 Fernández + Hernández - Upload a Document to Scribd

Acta zoológica lilloana 50 (1–2): 1 0 9 – 11 3 , 2006 109 Proteínas asociadas a las micelas de caseína en leche de mamíferos silvestres Fernández, Francisco 1 2 1y Marcela Hernández de Sánchez 2 Facultad de Ciencias Naturales e IML-U.N.T. Fundación Miguel Lillo, Miguel Lillo 251, Tucumán. Esta dirección de correo electrónico está protegida contra los robots de spam, necesita tener Javascript activado para poder verla ; Esta dirección de correo electrónico está protegida contra los robots de spam, necesita tener Javascript activado para poder verla RESUMEN — La estructura de las micelas de caseína está determinada por la necesidad de mantener a este grupo de fosfoproteínas en suspensión dentro del medio lácteo. Estas moléculas, fundamentalmente la β-Cn y los dos tipos de α-Cn, son muy hidrofóbicas, la κ-Cn contribuye a mantenerlas en suspensión merced a su condición anfipática. El objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de proteínas no-caseínicas entre los componentes de las micelas de caseína en un grupo de nueve especies de mamíferos silvestres. Para ello se llevaron a cabo electroforesis en distintas condiciones. Los resultados muestran que las micelas presentan proteínas adicionales a las Cns, las cuales eran diferentes en distintas especies, sus pesos moleculares varían entre 20 kDa y 120 kDa, se encuentran en distintas concentraciones entre diferentes especies, no son proporcionales con las concentraciones de Caseína, tienen un cierto grado de hidrofobicidad, son independientes de los polímeros de caseína. Algunas proteínas asociadas corresponden a proteínas previamente identificadas por sus características funcionales además, las especies animales relacionadas muestran patrones de proteínas asociadas parecidos. Se pueden elaborar las siguientes conclusiones en base a lo dicho anteriormente: las micelas de caseína de las leches estudiadas presentan proteínas adicionales que difieren según las especies. Las especies animales relacionadas muestran patrones de proteínas asociadas parecidos. Las proteínas no caseínicas jugarían un rol adicional en el mantenimiento de la solubilidad (dispersión) de las micelas de caseína. La presencia de estas proteínas constituiría un rasgo a favor del cual habría una presión de selección, puesto que la estabilidad de las caseínas tiene un valor biológico que se debe proteger cuidadosamente. PALABRAS CLAVE: Leche, micelas, caseínas, proteínas asociadas, mamíferos silvestres. A B S T R A C T — “Proteins associated to caseine micelles in milk of wild mammals”. The structure of the casein micelles is determined by the necessity to maintain this type of phosphoprotein group in suspension within the lactic medium. These molecules, fundamentally the β-Cn and the two types of α-Cns, are very hydrophobic, the κ-Cn contributing to maintaining them in suspension thanks to its amphipatic condition. The objective of this study was to determine the presence of non-caseinic proteins within the casein micelle components in a group of nine species of wild mammals. In order to do this, electrophoresis were carried out in different conditions. The results show that the micelles present additional proteins at the Cns: they vary in different species; their molecular weight ranges from 20 kDa to 120 kDa; they are found at different concentrations in different species; they are not proportional to Casein concentrations; they have a certain amount of hydrophobicity; they are independent of caseine polymers. Some associated proteins correspond to proteins previously identified by their functional characteristics. Moreover, related animal species show patterns of similar associated proteins. The following conclusions are proposed: casein micelles of the milks under study present additional proteins which differ depending on the species. Related animal species show patterns of similar associated proteins. Non-caseinic proteins may play an additional role in the maintenance of the solubility (dispersion) of the caseine micelles. The presence of these proteins may constitute a trait which is favored by selective pressure, since the stability of the caseines has a biological value which must be protected carefully. KEYWORDS: Milk, micelles, casein, associated non-caseinic proteins, wild mammals. INTRODUCCIÓN La estructura de las micelas de caseínas (Cns) está fuertemente determinada por la necesidad de mantener en suspensión este tipo de proteínas en la leche de los mamíferos (Dalgleish, 1998). Estas fosfoproteínas representan, en la mayoría de las especies estudiadas hasta el presente, la mayor parte del aporte proteico que la madre entrega a la cría durante la lactancia (Fernández y Saad de Schoos, 1999). Estas moléculas, fundamentalmente la β-Cn, α s-1-Cn y α s-2-Cn son lo suficientemente hidrofóbicas tal que precipitarían en el medio lácteo si no hubiera otras moléculas que las mantienen en suspensión (Creamer et al., 1998). Existe 110 F. Fernández & M. Hernández: Proteínas asociadas a las micelas de caseína coincidencia sobre el hecho que una cuarta caseína, la κ-Cn, contribuye en forma importante a mantener en suspensión al resto de las Cns merced a su condición anfipática determinada por un sector hidrofóbico carboxi-terminal, y por otro segmento de la molécula de naturaleza hidrofílica (Walstra, 1990). De hecho la importancia que se les concede a las moléculas de κ-Cn en el mantenimiento de las micelas es tan grande que no existen referencias en la bibliografía a la contribución de otras proteínas en esta función. La estructura de las micelas es un tema sobre el cual se ha investigado mucho y existen múltiples contribuciones, a tal punto que el problema se considera prácticamente cerrado (Phadungath, 2005). Se debemos mencionar que la mayor parte de los estudios se han llevado a cabo en leche de vaca, de cabra, oveja ó de nuestra propia especie. Teniendo en cuenta que las tres primeras representan una sola Familia, los Bovidae entre los artiodáctilos, y la última comprende el caso de una especie que solamente contiene α s2Cn en cantidades muy pequeñas, se da una situación que no es representativa de lo existente en la totalidad de los mamíferos. A lo anterior se debe agregar lo relacionado con el hecho que existe una conciencia generalizada en el sentido que se supone y sobrentiende que las “micelas de caseínas” están formadas, —o pueden potencialmente estar constituidas solamente— por moléculas de caseína. Ello trajo como consecuencia que los trabajos experimentales sobre el particular muestren un claro y entendible esmero, en los métodos utilizados, en separar las moléculas de caseínas de otras moléculas asociadas a las micelas. Este paso en el trabajo de purificación no es un tema menor por el hecho que la separación de las proteínas no-caseínicas es generalmente un trabajo arduo y llega a ser frustrante cuando se evalúan los resultados con métodos analíticos muy sensibles. Este último aspecto puede constituir un problema al momento de definir la naturaleza de la estructura micelar. Un aspecto importante de esta situación sería establecer si estas moléculas asociadas son importantes o necesarias para la estabilidad, función y cinética de las micelas. El objetivo del presente trabajo fue determinar la existencia de proteínas nocaseínicas y el grado de constancia de su presencia entre los componentes de las micelas de caseína en un grupo de nueve especies de mamíferos pertenecientes a seis Familias distintas. M AT E R I A L E S Y M É T O D O S Las muestras utilizadas correspondieron a caseínas precipitadas que fueron lavadas exhaustivamente antes de someterlas a electroforesis. Los métodos utilizados incluyeron electroforesis (Harris y Angal, 1989) llevadas a cabo en distintas condiciones, con y sin agentes reductores. 1. ANIMALES UTILIZADOS Y ORIGEN DE LAS MUESTRAS Se utilizaron muestras de leche pertenecientes a varias especies de mamíferos de Reservas y Centros Biológicos de nuestro país. Las muestras de leche de corzuela (Mazama gouazoubira, Cervidae, Artiodactyla), mono caí (Cebus apella, Cebidae, Primates) y oso hormiguero (Myrmecophaga tridactyla, Myrmecophagidae, Xenarthra) fueron extraídas por ordeñe manual previa inyección de 0,5 ml de Hipofisina “Biol”, que corresponden a 5UI de oxitocina. Para obtener las muestras de tapir (Tapirus terrestris, Tapiridae, Perissodactyla) no fue necesaria la inyección de oxitocina y la extracción también se realizó por ordeñe manual. Estos animales pertenecen a la Reserva Experimental de Horco Molle de la Facultad de Ciencias Naturales e IML de la Universidad Nacional de Tucumán. Las muestras de lobo marino (Otaria flavescens, Otariidae, Pinnipedia) y elefante marino (Mirounga leonina, Phocidae, Pinnipedia) corresponden a animales pertenecientes a la Reserva de Punta León y de la Península Valdés, Chubut, respectivamente. Para la extracción de estas muestras se empleó una bomba de suc- Acta zoológica lilloana 50 (1–2): 1 0 9 – 11 3 , 2006 111 nas asociadas— se utilizaron dos procedimientos, la precipitación en medio ácido, y la centrifugación a alta velocidad. Las precipitaciones en medio ácido se efectuaron llevando a pH 4,5 mediante agregado de buffer acetato de sodio (500 mM). La precipitación mediante centrifugación se llevó a cabo en una centrífuga tipo Eppendorff a 14.000 rpm en las condiciones a que más abajo se detallan. Las muestras utilizadas correspondieron a caseínas precipitadas que fueron exhaustivamente lavadas con buffer acetato 100 mM pH 4,3, y con agua destilada antes de someterlas a los pasos posteriores. Las muestras lavadas según el procedimiento anterior se dividieron en tres alícuotas. La primera fue resuspendida en buffer acetato pH 4,5 con el agregado de Tritón X-100 al 2%, y luego fue centrifugada a alta velocidad. El precipitado fue utilizado para electroforesis con agentes reductores. La segunda fue resuspendida con buffer Tris-HCl, 50 mM pH 7,20 y posteriormente centrifugada, utilizándose el precipitado en electroforesis. La tercera fue utilizada directamente sin tratamiento. Algunas de las muestras fueron sometidas a PAGE-SDS con agentes reductores, ditiotreitol y 2-mercaptoetanol. Los geles, fijados y teñidos con Coomassie blue se escanearon con un scanner HP Scanjet 4070. Posteriormente las imágenes se digitalizaron con el programa QuantiScan (Biosoft, 1999) y se determinaron las concentraciones relativas a cada banda. R E S U LTA D O S ción manual, fabricada con una jeringa de 60 cc y una cánula adaptada al pezón de las hembras. Previo a la extracción se inyectó oxitocina, 15 UI, a los lobos marinos y alrededor de 80 y 150 UI para los elefantes marinos. La época de lactación oscilaba entre los primeros días posparto y los días previos al destete. No se utilizaron muestras correspondientes al período calostral de ninguna de las dos especies para el estudio de las caseínas. Las muestras correspondientes al quirquincho común (Chaetophractus villosus, Dasypodidae, Xenarthra) y quirquincho chico (Chaetophractus vellerosus, Dasypodidae, Xenarthra) fueron obtenidas por ordeñe manual. Previo a la extracción se le inyectaron a las hembras de estas dos especies 0,25 ml de Hipofisina (Biol) que corresponden a 2,5 UI de oxitocina. Estas muestras fueron proporcionadas por la Cátedra de Fisiología Animal de la Universidad del Sur, Bahía Blanca. Las muestras de venado de las pampas (Ozotocerus bezoarticus, Cervidae, Artiodactyla) fueron obtenidas de animales pertenecientes a la Reserva de Vida Silvestre Campos del Tuyú, Fundación Vida Silvestre, General Lavalle, Buenos Aires, mediante ordeñe manual sin inyección de oxitocina. Las edades aproximadas de las hembras eran 3 a 4 años. El período de lactación en el que se encontraban las hembras muestreadas fue de 7 a 8 meses. 2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Todas las muestras de leche de los diferentes orígenes fueron tratadas de la misma manera para su conservación: en primer lugar se les agregó una gota de bicromato de potasio 1% por cada 3 a 5 ml de leche, luego fueron refrigeradas y trasladadas al laboratorio donde se las conservó a –20 ºC hasta el momento de su estudio. Para los ensayos se siguieron pasos principales correspondientes a: a) la precipitación de las caseínas; b) el análisis de los componentes del material precipitado. Para la separación de las micelas, del resto de los componentes de la leche, en este separación de caseínas —y de proteí- Los resultados mostraron que las micelas de la leche de las especies estudiadas presentaban proteínas adicionales a las caseínas. La Figura 1 corresponde a un esquema confeccionado en base a los geles realizados en PAGE-SDS en presencia de agentes reductores, fijados, y teñidos con Coomassie blue, de los distintos tratamientos mencionados anteriormente. En este esquema están representadas las nueve especies utilizadas en este estu- 112 F. Fernández & M. Hernández: Proteínas asociadas a las micelas de caseína dio. A continuación se realiza una breve descripción de cada una de ellas. Corzuela.— En la calle 1 del esquema se nota la presencia dominante de tres bandas de caseína cercanas a los 30 KDa. En la zona de los 60 KDa se evidencian dos bandas que corresponden a proteínas asociadas a las micelas de caseína. Venado de las pampas.— En la calle 2 del esquema aparecen tres bandas de caseína cercanas a los 30 KDa de intensidad bastante similar. También aparecen en la zona de los 60 KDa dos bandas de proteínas asociadas a las micelas de caseína. Tapir.— En la calle 3 del esquema se puede observar que aparecen las bandas de las caseínas monoméricas, dos en este caso de gran intensidad. También se puede observar una banda de peso molecular superior a las caseínas monoméricas (aproximadamente 60 KDa) y otra inferior a las mismas de 20 KDa. Lobo marino.— En la calle 4 del esquema aparecen dos bandas de igual intensidad de ≅ 30 KDa. Estas bandas corresponden a los monómeros de caseína de esta especie. En la zona de los 60 KDa aparece una banda tenue que podría corresponder a una proteína asociada a las micelas de caseína. Elefante marino.— En la calle 5 del esquema se pueden observar dos bandas principales de aproximadamente 30 KDa que coinciden con los pesos moleculares de las caseínas principales y otra banda de unos 60 KDa, la cual es una proteína asociada a las mismas. Mono caí.— En la calle 6 del esquema se presentan una serie de bandas de las cuales tres que pesan aproximadamente entre 30 y 35 KDa consideramos que corresponden a las caseínas monoméricas principales. Aparecen también otras tres bandas de ≅ 60, 66 y 90 KDa que podrían estar asociadas a las anteriores. Quirquincho común.— En la calle 7 del esquema aparecen tres bandas principales correspondientes a las caseínas monoméricas de esta especie, las cuales pesan alrededor de 30 KDa, encontrándose también dos bandas adicionales más pesadas de aproximadamente 40 KDa y 60 KDa como así también otra más liviana de 20 KDa. Quirquincho chico.— En la calle 8 del esquema aparecen tres bandas principales que corresponden a las caseínas monoméricas de esta especie cuyos pesos moleculares se encuentran alrededor de los 30 KDa. Como proteínas adicionales podemos observar una más pesada de aproximada- Figura 1. PAGE-SDS con agentes reductores de caseínas y proteínas micelares de la leche de: 1) corzuela; 2) venado de las pampas; 3) tapir; 4) lobo marino; 5) elefante marino; 6) mono caí; 7) quirquincho común; 8) quirquincho chico; 9) oso hormiguero. Acta zoológica lilloana 50 (1–2): 1 0 9 – 11 3 , 2006 113 consideramos que de hecho ello ocurre en el medio lácteo. CONCLUSIONES mente 60 KDa y tres más livianas (entre los 20 y 14 KDa) Oso hormiguero.— En la calle 9 del esquema se pueden apreciar cinco bandas más importantes que corresponden a los monómeros de caseína y pesan alrededor de 28 y 40 KDa. Además aparece una banda en la zona cercana a los 20 KDa que correspondería a una proteína asociada a la micela de caseína y otra de aproximadamente 15 KDa. DISCUSIÓN Del análisis de resultados se desprende que las proteínas asociadas a las micelas de caseína tienen distintos pesos moleculares que varían entre 20 kDa y 120 kDa y diferentes abundancias encontrándose en distintas concentraciones según las especies. Todas tienen un cierto grado de hidrofobicidad a juzgar por su solubilidad en el detergente utilizado en parte de los ensayos, son independientes de los polímeros de caseína cuyos monómeros se encuentran ligados por puentes disulfuro y además se comportan en forma similar a lo correspondiente a varias proteínas previamente identificadas por sus características funcionales. Todo lo anterior es compatible con un patrón estructural en el cual estas proteínas jugarían un rol adicional en el mantenimiento de la solubilidad (dispersión) de las micelas de caseínas. De hecho la estructura de las micelas constituye un armazón que tiene un tamaño variable, con una distribución de volúmenes que suele ser algo diferente para cada especie. Los diferentes modelos son compatibles con una estructura en la cual existan sitios hidrofóbicos que, aún cuando no estén expuestos, puedan ser accesibles desde el medio acuoso. En este contexto la posibilidad de que estos sitios sean cubiertos por sectores hidrofóbicos de otras proteínas no-caseínicas es altamente posible, y Las micelas de caseína de las leches estudiadas presentan proteínas adicionales que difieren según las especies. Las especies animales relacionadas muestran patrones de proteínas asociadas parecidos Las proteínas no caseínicas jugarían un rol adicional en el mantenimiento de la solubilidad (dispersión) de las micelas de caseína. La presencia de estas proteínas constituiría un rasgo a favor del cual habría una presión de selección, puesto que la estabilidad de las caseínas es un valor biológico que el organismo de la madre debe proteger cuidadosamente. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a la Dra. Marcela Uhart, Dra. Ema Casanave, y al Dr. Guillermo Schwint por la provisión de las muestras de leche de los animales estudiados. Asimismo a los dos árbitros anónimos por las observaciones efectuadas. BIBLIOGRAFÍA Creamer, L.K.; J. E. Plowman, M.J. Liddell, M.H. Smith, J. P. Hill 1998. “Micelle Stability: κcasein and Function” Journal of Dairy Science, 81: 3004-3012. Dalgleish, D.G. 1998. Casein micelles as colloids: surface structures and stability. Journal of Dairy Science, 81: 3013-3018. Fernández, F.M. y S. Saad de Schoos. 1999. “Funciones de los componentes de la leche. Un enfoque biológico. Opera Lilloana 44. Fundación Miguel Lillo, Tucumán. 164 pp Harris, E. L.V. y S. Angal. 1989. Protein purification methods. A practical approach. IRL at Oxford University Press, New York. 317 pp. Phadungath, Ch. 2005 “Casein Micelle Structure: a Concise Review” Songklanakarin Journal of Science and Technology, 27: 201-212. Walstra, P. 1990. “On Stability of Casein Micelles”. Journal of Dairy Science, 73: 1965-1979.